בויטכנולוגיה

סיכום שיעור 7

אילת ולנר

אילת ולנר

פרטי הסיכום

קורס: בויטכנולוגיה

מספר השיעור: 7

סיכום השיעור

בס”ד

סיכום שיעור 7 – ביוטכנולוגיה

ביולוגיה מבנית – המשך

  • כשמסתכלים על מבנה תעלות שנעשה ע”י דיפרקציה של קריסטל ניתן ממש לראות איך הן נראות – החלק החוץ ממברנלי, הציטופלסמטי, וכן כיצד החומר (קלציום / נתרן וכו’) עובר בתוכה.
  • הקריסטלים שצריכים לקבל צריכים להיות אחידים, כולל המודיפיקציות שעגב”יהם.
  • ביטוי חלבון:
    מגבירים את ה-cDNA הרצוי ב-PCR .
    2. מכניסים את המקטע לפלסמיד.
    3. מכניסים לחיידק ע”י heat shock.
    4. מגדלים את החיידקים במצע בררני, כך שרק החיידקים בעלי הפלסמיד ישארו (הפלסמיד מקנה להם עמידות לאנטיביוטיקה שבמצע).
    5. בודקים ב-PCR שיש את ה-DNA הרצוי במושבה נבחרת, וכן בודקים ב-western שיש את הפלסמיד.
    6. מגדלים את המושבה הנבחרת במצע נוזלי.
    7. מפוצצים את החיידקים ומנקים מתוכם את החלבון המבוקש.
  • יתרונות של גידול חיידקים: 1. עלות זולה. 2. כמות תוצר חלבוני גבוה.
    הבעיה: המודיפיקציות שלאחר קבלת החלבון אינן מדוייקות וגורמות לעיוותים ביחס לחלבון הנטיבי שנוצר בתאים הומאניים.
  • ניקוי חלבון: משתמשים במסננים ע”מ להוציא תא כל חלבוני החיידק פרט לחלבון שלנו, ע”י פרמטרים ותכונות שונות של החלבון הרצוי – כגון: הידרופוביות, גודל, מטען, שיירים ואפיטופיםהמצויים עגב”יו, GFP שסומן בו לכתחילה, וכו’. עושים כמה הפרדות בזו אחר זו כשכל אחת מהן מתייחסת לפרמטר אחר של החלבון ואז רוב הסיכויים שאקבל אך ורק את החלבון הרצוי.
  • קולונת אפיניות – כאשר מכניסים cDNA לפלסמיד מוסיפים לו שייר של 6 חומצות אמינו היסטידין שנקשרים חזק למתכות (ניקל או קובלט), וכך ניתן לנקות אותו בקולונת אפיניות המכילה מתכות אלו. מעבירים את ליזט החיידקים בקולונה שהבידים בה עשויים מהמתכות הנ”ל והן קושרות וקולטות אליהן את החלבון. שוטפים מספר פעמים ע”מ לנקות חלבונים אחרים שעלולים להיתקע בקולונה ואז עושים אלוציה של החלבון למבחנה נקיה. פרוצדורה זו מנקה כ-98% מהחלבונים הלא רצויים.
    ישנן קולונות שבאופן דומה שמים עגב”י הבידים שלהם נוגדנים אשר קושרים את החלבון הרצוי והם אלו שמסננים אותו מיתר החלבונים בליזט.
  • ניקוי עפ”י גודל – 1. ג’ל פילטרציה – מעבירים את הליזט בתוך קולונה שיש בה כדוריות ובהן חורים ותעלות שמעכבות את החלבון. החלבונים הגדולים בליזט יוצאים ראשונים כי הם עוברים בין הכדוריות ולא נכנסים אליהם כלל. החלבונים הבינוניים נכנסים לחלק מהחורים והתעלות ובכך מתעכבת יציאתם והם יוצאים שניים. החלבונים הקטנים מעוכבים ביותר היות ונכנסים ליותר חורים ותעלות וכך מתעכבים הרבה בדרכם כלפי מטה. אוספים פרקציות שונות של החלבון כאשר כל אחת מהם בגדלים ידועים ואז בוחרים את המבחנה בה הגודל הידוע של החלבון הרצוי. החלבון עובר בצורתו הנטיבית בלא שנעשה שימוש ב-SDS ע”מ לפתוח אותו, דבר המהווה יתרון.
    קולונת HPLC או FPLC – מזריקים את החלבונים עם מזרק לתוך קולונה ובה כדוריות דחוסות שמעכבות את החלבון – כך שהחלבונים מתעכבים בדרכם החוצה כתלות בגודלם ויוצאים בזמנים שונים. אוספים פרקציות שונות של החלבון כאשר כל אחת מהם בגדלים ידועים ואז בוחרים את המבחנה בה הגודל הידוע של החלבון הרצוי.
  • הפרדה עפ”י מטען – Ion Exchange.
  • גיבוש קריסטל – שמים את החלבון המסיס בתא-גיבוש ביחד עם תמיסה בעלת ריכוז כפול משל התמיסה המכילה את החלבון. מולקולות המים יוצאות מהתמיסה המכילה את החלבון אט-אט עד כל החלבונים מתגבשים ומסתדרים בקריסטל במבנה החוזר על עצמו (יכול לקחת בין שעה ל-20 שנה ויותר).
  • השלב הבא הוא הקרנת החלבון ב-X-ray . לשם כך יש 2 אפשרויות:
    דגים את החלבון על ידי מוט ובקצהו לולאה , מכניסים אותו לחנקן נוזלי לצורך הקפאתו ואז לוקחים אותו להקרנה (הבעיה שהקריסטל יכול להישבר במהלך הפעולה הנ”ל או במהלך השינוע).
    2. שיטה חדשה יותר – בתוך תא הגיבוש ניתן להקרין בקרינת X.
  • גיבוש קריסטל הוא נושא מאוד קשה ובעייתי, ישנן אנשים שמתמחים בכך ע”י שינוי שיירים על גבי חומצות אמינו מסויימות, יצירת מוטציות מכוונות בחלבון שמקלות על הגיבוש וכו’.
  • למאמרים הטובים מפרסמים מבנה גם ע”י קריסטלוגרפיה, גם במיקרוסקופ אלקטרונים, גם בפרדיקציה בתוכנה וגם בביוכימיה = עושים מוטציות מכוונות בחלבון ומראים את השיבוש בפעולתו (למשל – מוטציות ברצפטור שלא מאפשרות יותר קשירה של הליגאנד).
  • מטעינים את הקריסטל שדגנו עגב”י מכשיר שמקרין אותו בקרינת X. מזרימים כל הזמן עננה של חנקן נוזלי סביב הדגימה ע”מ לשמור על הגביש כמה שיותר יציב. מתקבלות דיפרקציות עגב”י סרט צילום כתוצאה מההקרנה. מסובבים את הקריסטל בכל הצירים (ציר X, ציר Y, וכן סיבוב שביב עצמו). מכשירים כאלו הם “ביתיים” מאוניברסיטאות ומיועדים להקרנת הגבישים ברזולוציה נמוכה יותר.
    ע”מ לקבל רזולוציה גבוהה יותר אשר מתבטאת ביותר אינפורמציה לגבי הגביש יש להקרין אותו בקרינה עוצמתית יותר. דבר זה ניתן לעשות במאיצי חלקיקים, אשר כתוצאה מפעולת האצת הפרוטונים בהם נוצרת קרינה חזקה ביותר (לא בכוונה תחילה, אלא כתוצר לוואי של פעולת ההאצה). אלו הם מאיצים חזקים וגדולים של 27-30 קילומטר שנמצאים מתחת לאדמה למקרה שיש זליגה של קרינה מהם – שתיבלע באדמה ולא תסכן אנשים.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X