ביוטכנולוגיה

סיכום שיעור 11

שמואל טריסטמן

שמואל טריסטמן

פרטי הסיכום

קורס: ביוטכנולוגיה

מספר השיעור: 11

סיכום השיעור

ב”ה

סיכום שיעור 11

בדרך למציאת ביטוי או המצאות של גן או רצף עומדות לרשותנו שיטות ביוטכנולוגיות מגוונות שכל אחת מאפשרת קבלת מידע גנטי או לגבי רצף ד.נ.א או ר.נ.א. FISH היא שיטה מיקרוסקופית בה משתמשים בפרובים פאלאורסנטים גדולים כנגד גן בכרומוזום. השיטה מאפשרת בדיקה של גנים או מוטציות ידועות בכרומוזומים, מציאת טרנסלוקציות וכן תקינות ושלמות של כרומוזומים. שיטה נוספת היא PCR  שמאפשרת לנו לקבוע ביטוי של גן או רצף DNA / RNA בתאי המטרה שלנו. החומר הגנטי עובר חיתוך רנדומלי ואז משתמשים בDNA פולימראז ובפריימרים ידועים מסומנים (פלאורסנטית או אחרת) בכדי להגביר את הרצף. לאחר מכן נוכל להריץ אותם בג’ל אלקטורופורזה ולהקרין אותם ולקבל בדיקה כמותית לגבי המצאות המקטע בדגימה. על ידי שיטה זו ניתן לבדוק האם ישנן מוטציות בגן ואנו נראה אותם כמקטע קצר יותר או כתוצאה שלילית, וכן את שעתוק הגן לדוג’ מוטציה בDNA שגורמת לייצור mRNA לא תקין או לא כפי המצופה ולכן לא נראה RNA של אותו הגן. פיתוח של שיטה זו ה- RT-PCR, מאפשר לנו גם לקבל מדידה כמותית יחסית של גן או השיעתוק שלו בדגימה נתונה ע”י בדיקה של הסבב שבו מזהים הסמנים (סבב מוקדם – כמות גדולה של עותקים / חיובי, מאוחר – מעט / שלילי). אנו נשווה את התוצאות לביטוי של גנים house-keeping. כיום יש שיטה המאפשרת מדידה כמותית אבסולוטית של רצפים ע”י שימוש בבועיות לצורך ביצוע הראקציה. החסרונות של השיטה הן שעלינו לדעת הרצף של המקטע הרצוי, אורך וכמות הרצפים הנבדקים מוגבל ועלולות להיווצר טעויות במהלך הראקציה של הפולימראז. השיטה המקדמת יותר לבדיקת ביטוי גנים היא הMicroarry שמאפשרת הבנה כמות הביטוי של גנים רבים. בשיטה זו אנחנו מכינים על גבי זכוכית כמות גדולה מאוד של פרובים מסומנים לרצפים של גנים רבים ומטעינים על גבי הזכוכית את הדוגמא שבה נמצאים הרצפים המשלמים שמסומנים בסמן שיוצר ראקציה פלאוסנטית עם הסמן של גבי הפרוב, וכאשר יש צימוד – נוצר תוצר שניתן לזהות ולכמת אותו על פי רמת הזהות בין הרצפים. גם שיטה זו מחייבת אותנו לדעת את הרצפים של הגנים הנבדקים. ישנת כמה שיטות לביצוע ריצוף עמוק: הראשונה היא סנגר, שמבוצעת באמצעות פולימראז, dNTP ו-ddNTP של ארבעת הנוקלאוטידים, מסומנים רדיואקטיבית או פאלורסנטית. הפולימראז מבצע הכפלה של הרצף ובכל פעם נעצר במיקום אחר ברצף וכך נוצרים לנו רצפים חופפים בגדלים שונים. מריצים בג’ל ומקרינים או חושפים את הג’ל וכך “קוראים” את הרצף. שיטה נוספת היא הריצוף הקפילרי, בו הרצף נחתך למקטעים קטנים ומועבר דרך קפילרה שבה יש גלאי פלאורסנטי והכל מקטע עובר בצורה יחידנית מול הגלאי והוא מזהה את הנוקלאוטיד ע”י הצבען שמחובר אליו.  שיטה מתקדמת יותר משתמשת בזכוכית לה מצמידים רצפים קצרים והמשלימים להם בצברים. מתבצע חיתוך של הרצף ומצמידים לכל מקטע משתי צדדיו את הרצפים שנמצאים על הזכוכית והוא עובר הגברה. הדוגמא מוטענת על גבי הזכוכית ונוצר צימוד. פולימראז מסנטז את הדגיל המשלים והמקורי מפונה. בעזרת יצירת גשר, הרצף המשלים מועתק שוב לדו גדיל ואז שוב עובר הפרדה. הסינטזה מתחילה ויכנס נוקלאוטיד מתאים, שמסומן בצבען ומצומד לו תוסף שלא מאפשר את המשך הסינטזה. הזכוכית מוקרנת והגלאי מזהה את הצבען שיחודי לכל נוקלאוטיד. הסמן דועך ואז גם משתחרר התוסף ומשיכה הסינטזה.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X