ביוטכנולוגיה

סיכום שיעור 12

GeniaY

GeniaY

פרטי הסיכום

קורס: ביוטכנולוגיה

מספר השיעור: 12

סיכום השיעור

אחת השיטות המתקדמות לכימות ביטוי גנים ברמה של תא בודד היא Nanostring technology. השיטה לא דורשת את שלב ההגברה ומודדת את תכולת חומצות הגרעין באמצאות קשירת פרובים מתקדמים וספירת ישירה של מולקולות.

ריצוף עמוק מתייחס לריצוף של אזור גנומי מספר פעמים, לפעמים מאות ואף אלפי פעמים. גישה זו של הדור הבא של רצף (NGS) מאפשרת לחוקרים לזהות ביטוי גנים נדיר, תאים או חיידקים המהווים פחות מ -1% מהמדגם המקורי. שימושי למחקרי סרטן, מיקרוביולוגיה ומחקרים אחרים הכוללים ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירות. לדוגמה, רצף עמוק נדרש לזיהוי מוטציות בתוך גידולים, מכיוון שזיהום תאים רגיל נפוץ בדגימות סרטן, והגידולים עצמם ככל הנראה מכילים מספר שיבוטים רבים של תאים סרטניים.

כיום מכשירי Illumina  תופסים נתח עיקרי של השוק. ניתן לחלק את תהליך העבודה שלבים עיקריים: הכנת דגימות (הפקת חומצות גרעין והכנת הספרייה); ריצוף ואנליזה. הכנת הספרייה היא קריטית להצלחת זרימת העבודה שלך ב- NGS. שלב זה מכין דגימות DNA או RNA להיות תואמות לרצף. ספריות רצף נוצרות בדרך כלל על ידי שבירת DNA והוספת מתאמים מיוחדים לשני הקצוות. בתהליך העבודה של רצף Illumina, מתאמים אלה מכילים רצפים משלימים המאפשרים לשברי DNA להיקשר לתא הזרימה. לאחר מכן ניתן להגביר ולטהר שברים. כדי לחסוך משאבים, ניתן לאגד מספר ספריות יחד ולרצף אותן באותה ריצה – תהליך המכונה multiplexing. במהלך קשירת מתאם, רצפי אינדקס ייחודיים, או “ברקודים”, מתווספים לכל ספרייה. ברקודים אלה משמשים להבחנה בין הספריות במהלך ניתוח הנתונים. במהלך שלב הריצוף של זרימת העבודה NGS, ספריות נטענות על flow cell. אשכולות שברי ה- DNA מוגברים בתהליך שנקרא clustering, וכתוצאה מכך מיליוני עותקים של DNA חד-גדילי. ברוב מכשירי הרצף של Illumina, clustering מתרחש באופן אוטומטי. בתהליך הנקרא ריצוף על ידי סינתזה (SBS), נוקליאוטידים מהונדסים כימית נקשרים לגדיל תבנית ה- DNA באמצעות השלמה טבעית. כל נוקלאוטיד מכיל תג פלואורסצנטי ומסוף הפיך החוסם את שילוב הבסיס הבא. האות הפלואורסצנטי מציין איזה נוקלאוטיד התווסף והחסם נחתך כך שהבסיס הבא יכול להיקשר. לאחר קריאת גדיל ה- DNA הקדמי, מתרחשת שטיפה, והתהליך חוזר על עצמו בגדיל ההפוך. שיטה זו נקראת רצף זוגי. לאחר הריצוף, תוכנת המכשיר מזהה נוקלאוטידים (תהליך הנקרא בסיס קריאה) ואת הדיוק החזוי של שיחות בסיס אלה. לניתוח נתוני ,NGS כיום ניתן להשתמש באפליקציות אינטואיטיביות לניתוח נתונים, ללא הכשרה ביואינפורמטיקה או צוות מעבדה נוסף. כלים אלה מספקים יישור רצף, קריאת גרסאות, הדמיית נתונים או פרשנות.

טכנולוגיית ריצוף RNA (RNA-Seq) מאפשרת פרופיל באופן מהיר וחקירה מעמיקה של התעתיק. גישה זו מציעה מספר יתרונות בהשוואה לניתוח microarray, טכנולוגיה שהייתה מקובלת במחקר ביטוי גנים. יתרונות: טכנולוגיית RNA-Seq אינה דורשת פרובים ספציפיים לגנים. הוא יכול לזהות תעתיקים חדשים, מיזוג גנים, הבדלים בנוקלאוטידים בודד, הוספה וחסר בנוקלאוטיד אחד ושינויים אחרים שלא היו ידועים בעבר שמערכים אינם יכולים לזהות. טכנולוגיית RNA-Seq יכולה לזהות אחוז גבוה יותר של גנים המתבטאים, באופן דיפרנציאלי, במיוחד גנים עם ביטוי נמוך.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X