ביוטכנולוגיה

סיכום שיעור 13

Rami.bk

Rami.bk

פרטי הסיכום

קורס: ביוטכנולוגיה

מספר השיעור: 13

סיכום השיעור

ריצוף ברמת התא הבודד בוחן את רצף הנוקלאוטידים מתאים בודדים תוך שימוש בטכנולוגיות ריצוף הדור הבא ( NGS, Next Generation Sequencing), טכנולוגיות המאפשרות הבחנה בדקויות ההבדלים בין תאים בודדים שונים בתוך רקמה ולאפיין תתי אוכלוסיות פונקציונליות של תאים המאפשרת הבנה טובה יותר של התפקוד של תא בודד בהקשר של מיקרו-סביבה שלה.

ריצוף ברמת התא הבודד מערב הפרדה לתאים בודדים, ביצוע הגברה לכל הגנום (WGA), בניית ספריות לריצוף המתאימות לטכנולוגיית הריצוף שבשימוש ולבסוף ריצוף הספרייה שנתקבלה במערכות ריצוף הדור הבא NGS (למשל מתוצרת אילומינה או איון-טורנט). ניתן להשתמש בריצוף ברמת התא הבודד במחקרי מטהגנומיקה (Metagenomics) ובריצוף אורגניזמים חדשים. ניתן לשלב ריצוף ברמת התא הבודד עם שיטות למיון תאים בתפוקה גבוהה של מיקרואורגניזמים ושל סרטן.  בריצוף ברמת התא הבודד נפוצה שיטת הגברה שאינה PCR הנקראת הגברה בריבוי העתקות (Multiple Displacement Amplification), אשר מאפשרת מחקר בגנטיקה של חיידקים, אקולוגיה ומחלות מידבקות. נוסף לכך, מידע שהופק ממיקרואורגניזמים יכול לבסס תהליך של גידולם בתרבית  בעתיד.   כמה כלים שיכולים לשמש עבור ריצוף גנום ברמת תא בודד כוללים: SPAdes, IDBA-UD, ואת Cortex ו- HyDA.

 

שיטות הגברה

 

הגברה בשיטת ריבוי העתקות  (Multiple displacement amplification) מאפשרת הגברה של חומר גנטי מרמות של פמטו-גרמים בודדים למיקרוגרמים לצורך שימוש בתהליכי ריצוף. החומרים הנדרשים לביצוע הריאקציה הזו הם פריימרים אקראיים ואנזים DNA פולימראז המופק מבקטריופאג’ phi29. בשונה מריאקציית PCR  להגברה, הריאקצית MDS מתרחשת בטמפרטורה קבועה של 30 מעלות. כשהפולימראז מבצע העתקה של גדיל התבנית ומייצר גדיל חדש, נוצרים מספר עותקים כאשר העותקים שנוצרו במחזור הקודם מוצאים החוצה מהתבנית.  התוצרים של  ריאקציית MDS הן באורך של כ-12 אלף נוקליאוטידים ויכולים להגיע לאורך של 100 אלף כך שיוכלו לשמש בריצוף דנ”א. שיטות אחרות המשמשות להגברה MALBAC.

 

מגבלות לשיטות ההגברה

לשיטת MDA יש הטיות בתהליך ההגברה בהשוואה לשיטת PCR הכוללות ייצוג-יתר או ייצוג חסר של חלקים מגדיל התבנית. כתוצאה מכך רצפים מסוימים אובדים ואותה הטיה נגררת למחזורי ההגברה הבאים. שתי שיטות להתגבר על ההטיות הן איגום של ריאקציות תא-בודד השייכות לתאים מאותו הסוג ואיגום לפני ביצוע הריאקציה. השיטות הנפוצות לזיהוי תאים מאותו סוג כוללות FISH ו-conformation characteristics.

 

רב צורניות של נוקלאוטיד בודד, סניפ  SNPs, המהווה חלק משמעותי מהשונות הגנטית בגנום האנושי ושונות במספר העותקים CNV מהווים בעיה בריצוף ברמת התא הבודד. כך גם הכמות המזערית של חומר גנטי הנמצאת בתא בודד. לכן למרות ההגברה קשה לנתח באופן מדויק את כמויות הדנ”א מתא בודד משום שהכיסוי נמוך ורגיש לשגיאות. להגברה בשיטת ריבוי העתקות MDS הכיסוי הממוצע לגנום הוא 80% וסניפים שאינם מכוסים על ידי קריאות ייעלמו. בנוסף, בשיטה זו יש אחוז גבוה של השמטת אללים כלומר היעדר זיהוי של אללים מדוגמאות הטרוזיגוטיות. מספר אלגוריתמים לזיהוי סניפים נמצאים בשימוש אך אף אחד מהם אינו ספציפי לריצוף ברמת התא הבודד. בהגברה בשיטת ריבוי העתקות והשוניות במספר העותקים CNV קיימת בעיה של זיהוי שגוי של CNVs, ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות אלגוריתמים לזיהוי והורדת ה”רעש” והפקה נכונה של  variants.

 

יישומים

המיקרוביוטה היא מטרה עיקרית של ריצוף בתא בודד בשל הקושי לגדל את הדוגמאות בתרבית. ריצוף ברמת התא הבודד היא אחת הדרכים לזיהוי של המיקרוביוטה והגנום שלה. המיקרואורגניזם הראשון שהיה בשימוש בטכנולוגיות ריצוף תא בודד היה החיידק. לכשיושלם תהליך המחקר ואיסוף הנתונים של אורגניזמים אלו יתגלו תפקידים חדשים אשר ישליכו על בריאות האדם.

 

ריצוף סרטן הוא אחד היישומים המתפתחים של ריצוף ברמת התא הבודד. ניתוח וקטגוריזציה של רקמת גידול סרטנית ברמת, מציאת ארגון מחדש של קטעי דנ”א, שונות ברמת נוקלאוטיד בודד SNV, וריצוף גנום מלא ברמת תא בודד. scDNAseq – ריצוף דנ”א ברמת תא בודד שימושי במיוחד למחקר מוטציות של מולקולות ביולוגיות שהן מטרות לתרופות כגון קולטנים לטירוזין קינאז (הגנים EGFR ,PDGFRA וכו’) כאשר השיטות הרגילות של ניתוח ברמת הרקמה כולה עלולות לפספס מוטציות ברמת התא הבודד אשר עלולות לאפשר יתרות במסלולים ביולוגיים וכך ליצור עמידות של הגידול הסרטני.

 

ריצוף ברמת תא בודד של ה-Methylome

ריצוף ברמת התא הבודד לכימות המתילציה של הדנ”א.  השיטה דומה לריצוף דנ”א ברמת התא הבודד עם תוספת טיפול בביסולפיט לפני הריצוף.

ריצוף רנ”א ברמת התא הבודד scRNA-seq

השיטות הנוכחיות לכימות המצב המולקולארי של התאים (פרופיל ביטוי הגנים דרך ריכוזי רנ”א-שליח) בין אם במערך-דנ”א (microarray) או RNA-seq מבצעות מיצוע של הסיגנאל על פני אלפי או מיליוני תאים.  בהינתן השונות של אוכלוסיית תאים שיטות אלו מתעלמות מאינטראקציו בין תאים ומהשונות באוכלוסייה ההכרחית לשמירת תפקוד תקין של הרקמה ולהתפתחות של מחלות.  לכן מיצוע של תאים מספק מידע חלקי בלבד על המצב המולקולארי של המערכת.

 

ריצוף רנ”א ברמת התא הבודד מספק פרופיל ביטוי גנים של תאים בודדים. ניתן לזהות אוכלוסיות נדירות של סוגי תאים באמצעות ניתוח אשכולות ובכך לאפשר אפיון וזיהוי תתי-אוכלוסיות בתוך אוכלוסייה הטרוגנית. שונות באוכלוסייה של תאים סרטניים ניתן לייחס למוטציות נרכשות אך גם תאים הזהים גנטית ובאותה סביבה מראים שונות בפרופיל התבטאות הגנים והחלבונים שלהם . בנוסף, רנ”א במספר עותקים נמוך אשר יכול להפעיל פונקציות חשובות בתא הוא בדרך כלל קשה לאיתור או נחשב לרעש בשיטות המסורתיות למיצוע מספר תאים. ריצוף ברמת התא הבודד של מספר תאים רב יכול לזהות רנ”א לא-נפוץ שכזה ולגלות את הפיזור במספר העותקים באוכלוסייה. הידע לגבי צורת התפלגות הביטוי יכול לשמש להבנת מנגנוני בקרת השעתוק לדוגמה בשיטות של  Perturb-seq.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X