ולידציות וכיולים

סיכום שיעור 10

Alia

Alia

פרטי הסיכום

קורס: ולידציות וכיולים

מספר השיעור: 10

סיכום השיעור

ולידציות וכיולים 132386 :

שיעור מס.10 17.02.2021:

Validation and Verification in the Clinical Microbiology Laboratory:

תיקוף:מעבדה מיקרוביולוגיה:

תיקוף פשוט-צביעת גראם.

מערכת לגילוי חיידקים בדם.

צריך לבדוק השיטה,הערכה,המכשיר אם מתאימים לשימוש במעבדה שלנו.

האם בטוחים שהתשובות נכונות ואורך הזמן.

PART 1  : Modern Clinical Microbiology

New challenges and solutions

בקטריולוגיה:

Aerobic Bacteriology (Culture) :

Fecal , Resp.tract  ,Wound, Ocular ,Urine ,  Gential , CSF, Screening,  H.pylori ,  Nosocomial ,Tissue bank, Blood.

Mycology

Parasitology

Mycobacteriology

Anaerobic bacteriology

Serology

STD:Sexually Transmitted Diseases

Molecular Microbiology: בדיקות קורונהCovid 19

תפעול מעבדה:

קבלת דגימות:

תחום שחפת,סרולוגיה פרזיטים בדם

פרזיטים בצואה:מזכירות

הזמנת בקבוקי דם:הזמנת טפסים

בקבוק שליליBactec:     דווח תוצאות שליליות

Bactec: בקבוק חיובי-טיפול בבקבוק חיובי- קריאת תרביות,הוצאת תשובות-דווח תוצאות חיוביות

זריעות:

-דרכי נשימה,שתנים,עמוד שדרה

-זריעה כללית:נוזוקומיאלי,צואות,כלליות,מערכת מין,עיניים

הגדרת תרביות:

קריאת תרביות,הוצאת תשובות-דיווח תוצאות

תחום פטריות-Anaerobic ,תרביות אנאירוביות-מכשור חדשני-תחום מולקולרי.

Aerobic +Anaerobic +Fungal Blood Culture:

תשובה נראת מס.דגימה-מתי נלקחה –תשובה

מקום לקיחה:וריד מרכזי( דקירה חדשה )

מה מתקבל במעבדה:בקבוק 3

בקבוק יצא חיובי מאיזה כל דבר נובע

Gram Stain

Staphylococcus :חיובי מאיזה נובע /צמח

רגישות:Anti bio Gram

במה החיידק רגיש-תתאים לטיפול.

ביצוע תרביות:

א.זריעה( לאינקובציה) וצביעה לפירוש-24 h

ב.פירוש הצמיחה וביצוע זיהוי ורגישות-24 h

רגישות בדיסקיות-זיהוי ב MALDI

זיהוי ורגישות בפניקס.

Laboratory Diagnosis of Infection:

Unstained or stained e.g. Gram stain:stain- Decolorise-counterstain

Microscopy:30 min-4 h

Identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony-on plates or in broth.

Culture 18-24 h

Serodiagnosis-DNA technological by disc diffusion methods breakpoints or MICs

Sensitivities 48-72 h.

Slide-Inoculation

תרבית :מחקר 18-24 h

קריאה של תוצאה-לא כמו כימית-המטולוגית

Containers with Samples

להתרחש-לצמח חיידק

עוד 24 שעות נקבל תשובה של רגישות וזיהוי

מבחנות

מטוש :גרון

Sterile/Non sterile

צביעת גראם Gram Stain:

צביעת גראם- זריעה על צלחת

גראם: שיטה של צביעה של חיידקים  לפני מאה שנה.

נכין סלייד בצורה מסוימת : למשל דם בצורה מסוימת גם רקמה נכין בצורה אחרת.

חיידקים  מתחלפים ל 2 קבוצות:

חיידקים גראם חיוביים-חיידקים גראם שלילים.

חיידקים גראם שליליים:

Fixation: קיבוע של דגימה על סלייד

Crystal violet: צובעים כחול

Iodine treatment

Decolorization:סוג אחד כחול

Counter Stain Safranin:צבע נגדי ורוד

כחול:חיובים Gram+

ורוד:שלילי Gram Negative

לפי זה רופא –תיקוף יכוון, Gram באותו יום יוצא.

Morphology of B.cells:coc gram +

Coccus Bacillus

Plemorphic: פעם בשבוע האם הוא שלילי או חיובי,מאוד קשה להחליט איך Bacillus .

Staining:

מכשירי צביעה- סלייד מכניס ל centrifuge

12 סליידים מסתובבים בתוך מכשיר.

אם מחוברים כולל מים, נשפץ על סלייד תוך מכשיר-שיטה-סטנדרט נקי.

תיקוף יש 5 תיקיפי למכשיר ההוא.

בהגדלה 1000,100,10

תאים:neutrophile-

פלורא מעורבת-כחולים גדולים-שליליים,cocco bacilli נצבע מכיך או בצע מזוהם

כמות תאים-חיידקים מציינים.

Inoculation and ISO:

זריעה דרך מטוש מחלקים צלחת ל 4 חלקים, חייבים לבודד  תכניכה של בודד,לוקחים זריעה-חד פעמית מחט פלסטיק זריעה-ביטוח מאוד ומעברים ל Incubator h18-24 הפסים שזרענו-חיידק-דגימה

חיידקים צמחו על צלחת.

תרבית מעורבת-חשוב:

ירוק,קטן,מושבות לבנות צהובות

המוליזה אוכל RBC

תרבית גרון יותר מעיים

כמה מושבות הוא רואה-בירור של תוצאה.

בגוף שלנו יש Normal Flora זה נמצא ב מעיים,מערכת נשימה עליונה,אף אוזן גרון עיניים,על עור-חיידקים טובים משחק מיקרואנטי

Pathogen-מוגלה בבצע.

Pathogen לכן משתמשים צלחות Selective

דלקת גרון-Strep B  אז צלחת ספציפי

דגימת צואה-Selective

Shigella – Helicopacter -Salmonella

רק מחלה

Sterile- מה צריך להיות :Sterile  כמו מוח עצם ודם-עמוד השדרה-רקמות –CSF

עברים פנימית

פלורה נקייה-מעורבת לא אופיוני לדם

חיידק אחד בדרך כלל ,חיידק אחד-וירוס אחד

אחרת-תערובת זיהום של חיצונחי באופן שגוי

תרבית מחט מזוהם

חיידקים צומחStaph-Strep  בתרבית.

שחפת: לוקח יותר זמן לצמוח

Mycoplasma משהו אחר

Serological-Molecular—פטריות

שם משפחה:קבוצה מורחבת שני מילים .שם משפחה Escherichia spei

ID-Identification:

רוב הטסטים לא משתמשים במעבדה:

למשל Catalase test,Enzyme test,phenol red Mannitollant,hemolsis   לחיידקים לא משתמשים.

Antimicrobial Susceptibility Tests:

נותן ידע על הבחירת agent מתאים לantimicrobial therapy .

AST Methods Interpretation:

Agar disk diffusion method: qualitative – Microdilution and agar gradient: quantitative

Selection of Drug to test-Selection of a colony to test-use of Disk Dispensers-Measuring conditions :caliper, Ruler.

Etest -antimicrobial gradient method.

 

References:

Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing-EUCAST

ID + AST =Phoenix/Vitek

Standardization

Detection of MIC

ID to the species level

No media preparation( for non- fastidious)

Simultaneously performance of 1-100 ID/AST determinations

Continuous monitoring

תכניכה הפיזיקה משתמשים ביותר  MS.לזיהוי חיידק

Mean Target:כרטיס ימינה

מתחת קטן מאוד 7cm/4cm

מורחים סט מושבה target של חיידק-שיניים מושבה אחת,מס על Target,מכשיר:מושבה

MALDI TOF MS:

מתפסס על שיטה MS/BROKER

Performing a MALDI run:

Matrix assisted laser Desorption/Ionization:ɑ-cyano-4-  hydroxylcinammic acid is added to crystallize proteins for analysis, a laser is shot onto bacterial preparation ,proteins are ionized by the laser and are picked up into the vacuum and accelerated to the detection electrode ,time of flight :acceleration electrode.

מרחנו מושבה:Matrix

על מושבה סמנו Matrix

תפקיד של Matrix :LASER   יורא, מושבה-חלבון,נקרפת:חומר יתן הגנה על חלבונים,חפשו-מצאו

1Micro L.Matrix

מכנסים לתוך מכשיר,ליזר יורא עיגול,יצרו החלבון בתוך תא.

תמונה של PK אופיונים.

זיהוי שיטה פיזית,איך כימיה וביולוגיה-פיסיקה נקייה

Revolution in Microbiology:

10  שנים עם  השיטה,canal לגבי דם לגבי זיהוי.

AST:

רגיש

יציב

לפעמים החיידקים משנים משהו בגינום שלהם

Antibiotic החוצה,סנטזה של חלבון מתאימים את עצמם

מהיר-מעשה אמין

שיטה:Fugen  נבעו מ Process Dilution

Gold Standard:

A test method currently accepted as reasonably,but not necessary 100% accurate,the new test maybe more accurate than the accepted gold standard.

מכינים מיהולים שורה תחתונה חיידק צמח

Microgram : Millileter

Susceptibility

לא במעבדה נוטינות

Disk Diffusion Agar:

מטוש כל מני סוגי של מושבות,כמות מסוימת

פלטס סטנדרטית

שיטת דישא-שטיח:מושב נלקח ממושבות נקיות

שפרפרת

Reading: 24 h incubator

R-resistance חיידק יציב

S-susceptible חיידק רגיש

R-Bencillin

Measuring: קוטר מקצה לקצה

From Dic to Diam

CLSI:

פנאי צמח שתן-בדם:רק בשתן אין רגש –חייידק כליות

רק IV  רופא לוקח על עצמו המון פרמטרים במיקרו אין 100%, בקרת איכות 3 שעות

תיקוף נקודתי: לשחרר/ לא לשחרר

E test: Disks on Agar

על כל פס 250 שיטה שוודית

איך לקראו תוצאות:

CLSI2 גופים

E U CAST: כרטיס –Vitekכרטיס Phinex שיטה כלסיות.

שינו צבע דשל סוכר, מכשיר כזה:חוסך זמן מכשיר מזהה

R-intermediate

MIC-SSS

תרביות דם-רגישות ישרה מכנסים לפיניקס.

Vitek אותו דבר

BROKER: Blood Culture

150 דם בקבוק

למה דם:Anaerobic למנוע זיהום ,דוגמים תוך בקבוק.

דם יש ספסית על צלחת או אחד –בידוד.

Concentration of organisms in blood:

Adults: Gram negative bacteremia <1 to 10 CFU/ml, children:75% of children > 100 CFU/ml

ספסית חיידק אחד ל 1ml וחיידק אחד ל10ml liter .

עניין זיהומים נובע מcontamination  של עור-

Micobiology:contaminated-uncontaminated

לתפוס חיידק :שיטת Florescent Detector

בקבוק תוך מכשיר 1-5 ימים צביעת גראם מזהים חיידק בborker

Molecular:Detection of Pathogen

Parasite

MULTI PLEX

Pathogen: בצואה או שתן

STDS:7 Pathogens

PCR:REACTION   מגלה גין

ב בורסה למשל הפרמטרים עולים

Multi Plex stds:urine-vagina

שחפת-closterediom  -שלשולים-מוות

Part 2-Validation:

Cumitech: תיקוף ISO 15189

Terminology: שפה עברית

Defenitions: יתבצע תיקוף במעבדה אם השיטה עובדת

אם עדיין ממשיכה לעבוד

נתקף הכל אישור FDA  או לא

מתי לתקף: או שאנחנו משנים משהוא

Modified Test FDA.CE

Laboratory-Developed test (LDT )- RUO or IUS

כתיבת מאמר אם חדש ללא תיקוף.

Stright Forward

צביעת גראם פשוט יותר מתיקוף PCR   כי יש פרמטרים

Gold Standard ATCC Strains

תיקוף מתחיל מחיידקים לא מודסות

חיידק מקבלת Specification יש אנזיים מסוים או לפי רגישות או יציבות.

ביוב-אמפולט.

תכונות חויבים לתארי ומקפאים במעבדה,בשלב ראשון של כל תיקוףATCC

משפיע אם סטנדרט.

אין חיידק סטנדרט

בקרת איכות לא עובר-תיקוף לא מתאים.

Quality Assurace:

personal training ,PT ,QA ,Parallel testing of duplicate instruments, instrument maintenance and calibration, specimen identification and integrity ,QC/QA prevent detect and address errors and performance deviations.

Preanalytical -analytical- postanalytical

Statistics :Study components

ACCURACY- PRECISION –Analytical sensitivity –Analytical specificity

Accuracy and Precision: ability to produce accurate and precise results consistently over extended periods of time.

Precision (repeatability ):

לחזור לאותו חיידק ולקבל אותו תוצאות.

No. Of repeated results in agreement/Total no.of results *100

Analytic Accuracy:

Agreement between test result and ”True” result

No. Of correct results/Total no.of results *100

Sensitivity ( positive accuracy):

Analytic sensitivity measures the smallest quantity of analyte can reproduce distinguished from background levels.

No.of true positive results/No. Of true positive plus false-negative results *100

Specificity (negative accuracy ):

Analytic specificity is the apility of analytical method to detect only the analyte that it was designed to measure

No.of true -negative results/No. Of true negative plus false-positive results *100

PPV and NPV:

Percent of true positive or true negative

PPV-Probability of disease in a patient with a positive test result.

NPV-Probability of not having disease when the test result is negative.

PPV= no.of TP results/no.of TP plus FP results *100

NPV=no.of TN results/no.of TN plus FN results *100

Single Target Validation:

Selection

בדיקת הריון hcG-B

מאוד גבוה –Sensitivity שתן

Result:false positive results

שיטה:Diagnostic

B-hcG-ב דם-ultra sound דרישה ב speci/Sensitivity –כן לפחות 98%

לבנות תיקוף:צביעת גראם-צביעה ידנית-פיתאטם מכשיר צביעה.

מה יש לתקוף:אישור FDA-מה בודקים

מורחים לא מתאים לסליידים שלנו-חומרים לא מתאימים,למרוח כמה על הסלייד.

Selective plate,66 חיידק לא צמח אחר כך מנתחים תוצאות.

תיקוף מבחנות:מבחנה ללא תוסף,למשל שתן

בלי תוספת 37

גראם שלילי:pseaudomonas  מתרבה ביותר.

תיקוף תרבות דם:

בקבוק, מכשירים ,מחרז,מזון.

בקבוק חדש מספיק טוב.

מכשור מסוג אחר חייבת לתקף אם מתאים למעבדה שלנו,שינוי למתקון.

נושא לבקבוק אחר.

Carbamazon :חיידקים נפוצים בתוך מקום מסוים לעבוד על הזמנים,בקבוק עד 5 ימים

מכשיר חדש נתן Time Detection,אם יודע לגלות חיידקים אז נקרא ל יצרן משהו לא בסדר.

אם אותו יצרן-מכשיר משוכלל Pactex-SX  אין שום צורך בטיפול.

P.blood:

מי רופא-מדגים בקבוק ישן-חדש

חיידקים נפוצים מחלה Sepsis מבנק דם או מקום אחר מיהולים מכניס בבקבוק.

בודקים תהליך Preanlytical

10 CC  לבקבוק אחר

דוגמת יותר מ 2 בקבןקים עדיף 4 בקבוקים

דיגום בקבוק חדשCC  50 אם לא יסתדר לא הולכים על זה

חברה עושה את זה מתקפת.

הזמנת דם/  מנת דם /חיידק

בקבוקים.

2 Instruments:

Method 1:

15-20 חיידקים גורמים רלוונטים

Results organical:anaerobic  חיידקים ידועים

דם מבנק הדם-פג תוקף

אישור

3 רפואים במעבדה דגמו  מאותו דם.

Study  Design:

Categorical agreement-Essential agreement-Gold Standard- Categorical agreement

תיקוף מול מה

דיסקית חדשה-יש יותר מדי יקרה וזולה גם.

S10 R,אין MIS

Categorical agreement,E-Test

שני פרמטרים S10 R-מאמר: מספר של MIS מול מספר של MIS מול חברה אחרת מה מקובל.

לא מקובל.

מה מתרכש במעבדה קלינית עמוסה.

Precision essential agreement(PEA):Precision within+1 twofold dilution of the test antibiotic.MIC

Precision Categorical agreement(PCA):

Agreement with the interpretive results (susceptible/intermediate/resistant(SIR)) of the precision test isolate.

מעבדת מחקר:

Disk Blood/ Disk oxoid

רמות אי התאמות בין רגיש ליציב. אחוזים

E-Test:פירושים ssss R – כמה אי התאמות טבלאות T-x

MIC-number

השוואות מספרים S-R

MIC1:8

8 S  גם 1 S –Agreement הבדל MIC,לבדק-חריגות,1-8 קבעו,כפולים יש הבדל במיהול 1.

2 או יותר מצב חריג,יש 1 ו 2 ו3 יש לנו 3 הבדלים אז בין 1-8 חריג

+/- מקובל -1

יותר מ 2 מיהולים זה חריג.

Erythromycine X שיטה חדשה נותנת Errors

גרבה:ספרות,אין V.Major  Error מתעסקת רק עם Minor/Major מס.אי התאמות

Minor/ Majorשיטה עוברתץ

Sheba:2000בדיקות

ESBL-Detectiomn

תרבית דם-Enzyme אם לא מקובל לא מכנסים לשימוש.

אין התאמות גבוהים-Non Fermenter

ESPL-Enzyme Phenotype  למעבדה

Cephalosporin

20/30 day QC

פרקי תיקוף:

להשתמש-לא להשתמש

The results of test Vertification

יצרן-טעינו,חשוב את הטעויות אז כך זוכרים Further

Molecular  Method:

Bacteria-Enzyme-Gene

KPC-Producing K.pneumoniae

Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase

Bla kpc

I-intermediate

חיידק פלורא של מעיים,מערכת עיכול של פסיינטים,יותר אנטי מעיים,bla kpc –enzyme חיידק רכש את הגינום.

Patients:

טיפול נמרץ-מעברה את החיידק מאחד לשני

Mortality-CPE: Massive> 50%

בדיקות סיקור:מטושים Selective

24שעות רגישות-יציבות

שיטה מולקיולארית Gram Stain

שתי ערכות משתי חברות מול Gram Stain 100%-Specific

Level of Detection-LOD:the detection limit of the real-time bla KPC assay was 1 CFU.

K.Pneumonia :

אין cross activity

Results of culture :negative

Nucli SENS easy MAG:+ OF negative:7

Magna pureLC:+ OF negative: 5

2 Molecular רגישות אז 2 דגימות יותר רגישות

False Positive יש עוד שיטה GOLD STANDARD

Sequence-gene תיקוף לתכנן איך שצריך תוצאות מראש,שיטה מאוד רגישה-תיקוף רגיש

שיטה מתאימה-מה עושים הלאה.

CELL WORK.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X