טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 10

Shani israela sadon

Shani israela sadon

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 10

סיכום השיעור

 

טכנולוגיות מתקדמות – שיעור מס’ 10:

-PCR
, או בשמה המלא Polymerase Chain Reaction, היא שיטה שחוללה מהפיכה בביולוגיה המולקולרית ובמחקר הגנטי, וזיכתה את ממציאה בפרס נובל. הגאונות של השיטה, היא הקלות בה היא מאפשרת יצירת כמות אדירה של DNA מכמות זעומה על ידי שימוש באמצעים פשוטים יחסית. ב-PCR נעשה שימוש לא רק במחקר ביולוגי, אלא גם בבדיקות גנטיות, בדיקות זיהוי פלילי, מחקר רפואי ולמעשה כל יישום המערב שימוש ב-DNA. הסרטונים שלפנינו מתארים את שיטת ה-PCR על שלביה השונים. הסרטון השני מכיל הסברים באנגלית, על כן הוספנו תרגום והסברים בהמשך העמוד.

הכפלת DNA מתבצעת על ידי הפרדת הגדילים, התחברות אנזים ה- DNA polymearase לאחד הגדילים על באזור ההפרדה אל על גבי פריימר (תחל) וסנתיזה של ה-DNA ל פי תבנית הגדיל. ה-PCR עושה שימוש בעקרון זה, רק שהוא חוזר על השלבים עשרות פעמים ובכך מכפיל את כמות ה-DNA פי שתיים בכל שלב, כלומר 30 שלבים יצרו מעל מליארד עותקים מ-2 עותקים. היופי שבשיטה הוא שהיא לא מגבירה את כל ה-DNA, אלא רק מקטע ספציפי אותו קובעים מראש. לשם כך בוחרים זוג פריימרים (תחלים) – קטעי DNA התוחמים את האזור אותו רוצים להגביר. כל פריימר מתאחה עם גדיל אחר ובכך מגדיר את מקטע ההגברה.

ל-PCR שלושה שלבים מחזוריים, המתאפיינים בטמפרטורת עבודה שונה. מרכיבי התגובה הם: תבנית DNA דו גדילי, זוג פריימרים, נוקלאוטידים (אבני הבניין של ה-DNA), האנזים DNA polymerase ותמיסת מלחים המאפשרת את קיום התגובה.

שלבי התגובה הם: דנטורציה (פרימה), אנילינג (איחוי) אלונגציה (התארכות). שלב הדנטרציה מתבצע ב-95 מעלות, ובמהלכו שני גדילי ה-DNA נפרדים. שלב זה אורך כחצי דקה. בשלב האנילינג, מתאחים שני הפריימרים על הגדילים המנוגדים. שלב זה מתבצע בטמרטורה של בין 45-70 מעלות וזה תלוי באורך והרכב הפריימרים. בשלב האלונגציה, נקשר ה-DNA polymerase אל הפריימרים ומתחיל לסנתז DNA במורד הגדיל.

בתום המחזור הראשון, אם יצאנו ממולקולת DNA יחידה קיבלנו שתי מולוקולות DNA לא שלמות כלומר מסונתזות החל מהפריימר שנקשר אליהן. בתום המחזור השני נקבל כבר ארבע מולקולות מתוכן אחת מכילה רק את המקטע הרצוי. בתום השלב השלישי, כבר יהיהו לנו שמונה מולקולות DNA מתוכן ארבע מכילות רק את המקטע הרצוי. בתום השלב הרביעי יהיו לנו 16 מולקולות DNA מתוכן 8 מכילות את המקטע הרצוי וכך כמות ה-DNA רק עם המקטע הרצוי יגדל באופן לוגריטמי (מעריכי).בתום התגובה, מספר מולוקולות המכילות שאריות מה-DNA המקורי שאינו במקטע הנבחר יהיה כל כך נמוך ביחס לשאר, שזה יהיה זניח, וזאת משום שקצב הריבוי שלהם הינו קצב ישר (לינארי) אם יש 30 שלבים, יהיו 60 מולקולות ביחס ליותר ממליארד המולוקולת של המקטע.

שיטת ה-PCR הולידה שיטות רבות כמו ה-realtime PCR המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר קצב התרבות ה-DNA, מכאן ללמוד על קצב ביטוי הגן אותו הוא מקודד. שיטה נוספת היא ה- RT-PCR. שיטה זו מאפשרת הפיכת RNA ל-DNA על ידי הוספת האנזים reverse transcriptase שמקורו בוירוס ה-HIV והופך RNA ל-DNA ואז הגברתו. שיטה זו מאפשרת חקר ביטוי גנים ברקמות או תאים שונים. PCR משמש גם להוספת אתרי חיתוך אנזימטיים או מוטציות בקטעי DNA ולעוד יישומים רבים ומגוונים.

גל אלקטרופורזה – הפרדת ה-DNA בעזרת אלקטרופורזה. בשיטה זו יוצרים ג’ל צפוף וטוענים עליו את דגימת ה-DNA החתוך לחתיכות בגדלים שונים. כאשר מפעילים שדה חשמלי על הדוגמאות הן מתחילות לנוע לכיוון הקוטב החיובי (דנ”א בעל מטען שלילי). הדוגמאות נעות במהירות שונה לפי גודלן, הגדולות נעות לאט יותר והקטנות מהר יותר, וזאת בשל החיכוך עם הג’ל. ככל שהג’ל דחוס יותר מהירות הדוגמאות קטנה, וניתן להריץ חתיכות DNA קטנות יותר מבלי ש”יברחו”. היות ו-DNA אינו חומר הנראה לעין, צובעים אותו בעזרת חומר פלורסנטי (מסרטן) הנקרא אתידיום ברומיד. חומר זה זוהר בתאורת אולטרא סגול, ועל כן קל לראות את קווי הדנ”א בג’ל ולצייר פרופיל גנטי.

 

.

• Real-Time PCR
-PCR נגזרות רבות. אחת מהן היא שיטת ה- Real-time PCR (תגובת שרשרת של DNA פולימראז בזמן אמת). בשיטה זו קיימים אותם שלושת השלבים של ה-PCR הרגיל, בתוספת חומר המשחרר אות פולרסנטי עם היווצרות מולקולות DNA דו-גדיליות חדשות. כך ניתן לדעת כמה עותקי DNA קיימים בכל מחזור חימום, ולהשליך משם על פעילות הגן המקודד על ידי אותו מקטע DNA. יתרון נוסף לשיטה זו הוא רגישותה. תוצרי PCR רגיל נצבעים בצבע מיוחד (ומסרטן) שנקרא אתידיום ברומיד, ומופרדים על ג’ל אגארוז על ידי אלקטרופורזה (ראו ערך) דבר המאפשר הערכה איכותית (לא כמותית) של כמות ה-DNA. במקרה של Real-time PCR , המכשיר מכיל גלאי פלורסנציה מאוד רגיש המסוגל לתת מידע כמותי על כמות ה-DNA. החסרון היחיד של Realtime PCR הוא מחירו היקר (גם החומרים וגם המכשיר).
משתמשים ב2 פרובים עיקריים: SYBR GREEN ו- TAQMAN.

• NANODROP: בודק ריכוז ורמת ניקיון .
ספקטאופוטומטר 260/230, 260/280>1.8
LOW 260/280 – נוכחות של חלבון , פנול או סופג חזק ב/ליד 280ננו מטר.
LOW 260/230 – מעיד על נוכחות של חומרים הסופגים ב250 ננומטר כמו EDTA, קרבוהידרייט, ופנול.
• MIQE: the minimum information for the publication of qPCR experiments.
• DEEP SEQUENCING: NGS AND HTS
– NGS (next generation sequencing) : בשיטה זו, מרצפים מיליוני פרגמנטים קטנים של DNA בו זמנית. תוך 72-24 שעות מרצפים אלפי גנים או מאות מיליוני מקטעים של DNA. ובעזרת תוכנות מחשב מתקדמות, עושים אנליזה לרצפים ובהשוואה עם רצפים תקינים (reference) ומצליחים לזהות שינויים ברצף כולל שינויים הגורמים לתחלואה באדם.
שיטת ה NGS חוללה מהפכה של ממש בעולם הגנטיקה ובאמצעותה מצליחים לאתר עשרות מוטציות וגנים חדשים אשר גורמים למחלות מונוגניות (גן אחד גורם למחלה) ומחלות פוליגניות (מספר גנים במקביל המעורבים בביטוי הקליני) כולל השמנת יתר, סוכרת וסרטן.
למרות שהשימוש בטכנולוגיה NGS לא נחשבת כבדיקה קלינית אלא ״בדיקה במסגרת מחקר״ הבדיקה שימושית מאד בארץ ובעולם. בקלות ניתן לאמת כל מוטציה חדשה ע״י שימוש בשיטת ריצוף במכשיר SANGER ( בדיקה המוכרת כבדיקה קלינית).
בשיטת ריצוף הגנים NGS, ניתן לקרוא אלפי גנים במקביל בזמן ובמחיר סבירים ביותר. חברות שונות פתחו דרכים יעילות ושימושיות בשירות הגנטיקה הרפואית כולל: ריצוף פנלים של גנים האחראים למחלות מוגדרות (לדוגמא פנל של אוטיזם, אפלפסיה, קרדיומיופתיה, פולינוירופתיה, סרטן שד, ממאירות מסוג מגוון) ופנל ריצוף רפואי ה- medical exome.

• BIOANALYZER: ריצוף רנא מול טכנולוגיית מיקרו אררי.
יתרון לא משתמשת בPCR, מדברת על RNA כלומר מה שרואים זה מה שיש
חסרון – כמות הבסיסים שבהם ניתן להשתמש
הפתרון: החלפה של חומרים פלורסנטים ברצף ברקוד שמרצפים אותו וככה אין גבול לכמות הסמנים שניתן לבדוק

• Nanopore sequencing: תעלות מרצפות היא שיטת ריצוף ביופולימרים מהדור השלישי ומשמשת בעיקר לריצוף DNA או RNA. השיטה מבוססת על חדירת הגדילים המרוצפים דרך תעלה יונית בקוטר של ננומטרים בודדים בממברנה טבעית או מלאכותית, הנמצאת בתוך תמיסה פיזיולוגית. שינויים חשמליים בתמיסות בין שני צדדי הממברנה או בחריר עצמו תלויים בסוג הבסיס החודר, מדידת השינויים מאפשרת את זיהוי הבסיס. באופן זה ניתן לרצף את הגדיל השלם.
ריצוף בעזרת תעלות מרצפות מאפשר לרצף מקטעי DNA ארוכים. יתרון זה יאפשר בעתיד לרצף מולקולת DNA גנומית בזמן קצר ובאופן יעיל תוך כדי קבלת מידע על שינויים שחלו ברצף הגנטי כמו מקטעים שהוספו, מקטעים שהוסרו וכו’. למעשה, ריצוף בשיטה זו אינו מוגבל באורך ה-DNA. לשיטה זאת יתרון נוסף שכן, ניתן להשתמש בתעלה אחת לסוגים רבים של מולקולות DNA, כלומר השיטה אינה ספציפית אלא גנרית ולכן אינה דורשת הכנות מוקדמות, הגברה של המקטע וכדומה. יתרונותיה העיקריים של השיטה הם מהירות הריצוף ועלותו הנמוכה כי אינה דורשת שימוש באנזימים, כגון DNA פולמראז או בנוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית, אך חסרונה העיקרי הוא אחוז שגיאה גבוה.
• Sequence clustering: רצף קונצנזוס או רצף הסכמה מתייחס לנוקלאוטידים או לחומצות האמינו הנפוצים ביותר במקום מסוים במספר רצפים לאחר עימוד רצפים, תהליך שבו משווים מספר רצפים זה ביחס לזה. רצף הקונצנזוס מתואר על ידי השיירים הנפוצים ביותר בכל עמדה בעימוד.
מוטיבים רצפיים מסוימים יכולים לתפקד כרצפים רגולטוריים המבקרים ביוסינתזה, או כרצפי הכרה (Signal sequence) המכוונים מולקולה לאתר מסוים בתא. בשל חשיבותם של רצפים אלו משערים שהם נשמרים לאורך האבולוציה. במקרים מסוימים הקשר האבולוציוני בין מינים מסוימים ניתן להערכה על סמך מידת הדמיון ברצפי הקונצנזוס. המוטיבים הנשמרים נקראים רצפי קונצנזוס והם מראים אילו שיירים נשמרים ואילו שיירים משתנים.
אתר קשירת חלבונים, המיוצג על ידי רצף קונצנזוס, יכול להיות רצף קצר של נוקלאוטידים המופיעים מספר פעמים בגנום, ורצף שכזה עשוי להיות בעל תפקיד זהה במקומות שונים. לדוגמה פקטורי שעתוק רבים מזהים תבניות מסוימות בפרומוטורים של גנים שעל שעתוקם הם משפיעים. באופן דומה לאנזימי הגבלה יש לרוב רצפי קונצנזוס פלינדרומים שמתאימים לאתר אותו הם חותכים ב-DNA. טרנספוזונים פועלים באופן דומה בזיהוים את רצף המטרה לטרנספוזיציה.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X