טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 10

Malisbt 1

Malisbt 1

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 10

סיכום השיעור

מפגש 10 -14.2 טכנולוגיות מתקדמות

בשונה משיטת סנגר, השיטות מהדור החדש (next-generation sequencing) אינן נסמכות על זיהוי הרצף על ידי עצירת הפולימריזציה בכל עמדה ברצף בעזרת נוקלאוטידים מסוג ddNTP. במרבית השיטות החדשות מתבצע זיהוי הרצף על בסיס העיקרון “ריצוף על ידי סינתזה” (sequencing by synthesis), כלומר זיהוי הרצף של מולקולת DNA חד-גדילית מסוימת מבוצע במהלך הפולימריזציה של הגדיל המשלים ונסמכת עליה.

 

עם שיטות אלו נמנות השיטות הבאות:

 

ריצוף בשיטת 454 (Pyrosequencing‏ 454).

 

ריצוף בשיטת אילומינה (Illumina dye sequencing).

היא שיטת ריצוף וצביעה של חברת אילומינה, המשמשת לריצוף דנ”א כלומר לקביעת הרצף של זוגות בסיסים ב-DNA . שיטה זו מבוססת על שימוש בצבעים הפיכים אשר מאפשרים את הזיהוי של בסיסים בודדים בעת שהם מצורפים לרצף ה-DNA. שיטה זו מיושמת לרוב לריצוף אזורים מסובכים, כגון הומו-פולימרים ורצפים חוזרים. היא יכולה לשמש לריצוף מלא של גן או לאזור מסוים, גילוי RNA קטן, הכנת פרופיל מתליציה וניתוח אינטראקציות בין חלבונים לחומצות אמינו בכל הגנום.

ריצוף בשיטת Ion ‏ (Ion semiconductor sequencing).

ריצוף בשיטת Ion היא שיטה לריצוף DNA המבוססת על זיהוי פרוטון (יון מימן) המשתחרר בזמן פולימריזציית DNA. זוהי שיטה בה הריצוף מתבצע על ידי סינתזה, שבמהלכה הגדיל המשלים נבנה על גבי רצף גדיל המקור.

 

מכונת ריצוף בשיטת Ion Proton:  Ion semiconductor sequencer

אל מיקרו-באריות, המכילות את גדיל המקור מ-DNA אותו מעוניינים לרצף, מוזרמים לסירוגין בסיסי DNA – דאוקסיריבונוקלאוטיד פוספט, סוג אחד של חומצת גרעין בכל מחזור פעולה. אם הבסיס המוצג משלים לנוקלאוטיד המוביל בגדיל המקור, הוא מצורף אל הגדיל המשלים המסונתז, תוך כדי פליטת יון מימן, המאותת לחיישן יונים וזה מזהה כי התגובה התרחשה. אם ישנן חזרות ברצף המקור, מספר נוקלאוטידים יצורפו במחזור אחד. התרחשות זו תגרור אחריה  פליטת יוני מימן בהתאם וכן עליה פרופורציונית בעוצמת האיתות החשמלי.

 

שיטה זו נבדלת משאר שיטות הריצוף בכך שאינה מצריכה נוקלאוטידים מיוחדים או שימוש באופטיקה. שיטת ריצוף Ion מכונה גם בשמות: ריצוף Ion Torrent, ריצוף באמצעות pH, ריצוף סיליקוני או ריצוף באמצעות מוליכים למחצה (מל”מ).

 

ריצוף SOLiD ‏ (SOLiD sequencing).

ריצוף SOLiD (באנגלית: Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection; ריצוף באמצעות קשירה וזיהוי של אוליגונוקלאוטידים) היא טכנולוגיית Next Generation לריצוף DNA שפותחה על ידי Applied Biosystems והייתה זמינה מסחרית מאז 2008. טכנולוגיה זו משתמשת בקידוד דו בסיסי(2 base encoding) על מנת לרצף ולא ע”י סינתיזה ומאפשרת הפקה של כ-100 ריצופים בקריאה אחת.

התהליך של שיטה זו מחולק לארבעה שלבים:

 

1) הכנת ספריית מקטעי דנ”א: בהינתן דגימת דנ”א שהיא רצף המטרה שברצוננו לרצף, מכינים ספריית מקטעים בעזרת פרגמנטציה(יצירת מקטעי דנ”א מדגימת הדנ”א) על ידי שיטות שונות כמו: Nebulization, Sonication או Digestion. הטכנולוגיה מאפשרת שני סוגי ספריות – ספריות רצף יחיד(Single Fragment Library) וספריות דו-רצפים(Mate-Paired Library). כל מקטע דנ”א יהיה מחובר לאדפטורים ,P1 וP2, הראשון בתחילת המקטע והשני בסוף המקטע, והם למעשה רצפי נוקליאוטידים ידועים שבהמשך יעזרו להבין מה היא נקודת ההתחלה והסוף של רצף המטרה. הכוונה בMate-Paired Library היא שיש אפשרות למקבל את הריצוף כך ששני מקטעי רצפים באורכים ידועים יהיו מחוברים לשלושה אדפטרים. לבסוף, בספריה משתמשים כדי להכין אוכלוסיות בידים משובטים בשלב הבא.

 

2) הגברה בPCR: כל ביד מורכב מהרבה מקטעי דנ”א שמשלימים לאדפטור P1 מה שכמובן מאפשר את ההיברידיזציה בין הביד לבין מקטעי הדנ”א שהכנו בשלב הקודם. כמות הבידים גדולה בהרבה מכמות מקטעי הדנ”א – מה שמאפשר ברמה הסטטיסטית שכל מקטע דנ”א יקשר לביד משלו. לאחר מכן, מתבצע PCR על כל ביד, כך שכל ביד יהיה משובט באותו מקטע דנ”א. מתוך כל הבידים מסננים החוצה את הבידים הריקים שלא נקשרו למקטע דנ”א כך שנשאר רק עם הבידים שכן התחברו למקטע דנ”א ועברו הכפלה בPCR. מהלך זה נעשה על ידי הוספה של בידים שעשויים מפוליסטרין שנקשרים לאדפטר P2 (כך אוספים את הבידים הנחוצים) ובצנטריפוגה מסננים את הבידים הריקים.

 

3) שלב הליגציה: בשלב זה פרימר נקשר לאדפטר P1 ואחריו נקשר הפרוב בתבנית של אחת מ256 האפשרויות. לאחר מכן, אנזים ליגאז מחבר את הקשרים הכימיים בין הפרוב למקטע רצף המטרה במידה ותואמים. ואז חיישן קולט, מודד ומקליט את הפלואורוסנציה שנוצרה באותו חיבור על פי מולקולת הפלואורוסנציה שקשורה לחלק הZZZ של הפרוב. לאחר מכן, חלק הZZZ של הפרוב נחתך מה שמאפשר לפרוב הבא להתחבר בליגציה. וכך נעשה פרוב אחר פרוב עד סוף מקטע הדנ”א. את שלב זה מבצעים חמש פעמים בסה”כ, כאשר בארבע הפעמים הבאות הפרימר מתקזז בבסיס אחד בכל פעם. זאת משום שיש לנו מדד פלואורסנציה עבור כל נוקליאוטיד חמישי(עקב חלק הNNN בכל פרוב).

 

ריצוף בשיטת Nanoball ‏ 

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X