טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 11

Areen Masalha

Areen Masalha

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 11

סיכום השיעור

עשינו סיור במעבדה בבר אילן, הכרנו את המכשירים השונים שלמדנו עליהם FACS ו NGS.

היסודות לכימיה של NGS
באופן עקרוני, הרעיון העומד מאחורי טכנולוגיית NGS דומה לרצף CE.

DNA פולימראז מזרז את שילובם של טריפוספטים דו-סוכריבונוקליאוטידים שכותרתו פלואורסצנטית (dNTP) לתוך גדיל תבנית DNA במהלך מחזורים רצופים של סינתזת DNA. במהלך כל מחזור, בנקודת ההתאגדות, מזוהים הנוקלאוטידים על ידי עירור פלואורופור. ההבדל הקריטי הוא שבמקום לרצף קטע DNA בודד, NGS מרחיב את התהליך הזה על פני מיליוני שברים בצורה דומה במיוחד. יותר מ -90% מנתוני הרצפים העולמיים נוצרים על ידי כימיה של סינתזה (SBS) של Illumina. * היא מספקת דיוק גבוה, תשואה גבוהה של קריאות ללא שגיאות, ואחוז גבוה של שיחות בסיס מעל Q30.6–8 תזרימי עבודה של Illumina NGS. כולל ארבעה שלבים בסיסיים:
1. הכנת ספרייה – מכינים את ספריית הרצף על ידי פיצול אקראי של דגימת ה- DNA או ה- cDNA, ואחריו הסתגלות 5 ‘ו- 3’ (איור 3 א ‘). לחלופין, “תיוג” משלב את תגובות הפיצול והקשירה לשלב יחיד שמגדיל מאוד את היעילות של תהליך הכנת הספרייה. לאחר מכן מוגברים שברי קושרים במתאם ומגוברים באמצעות PCR ומטוהרים בג’ל.
2. יצירת אשכולות – ליצירת אשכולות, הספרייה מועמדת לתא זרימה שבו שבירים נלכדים על מדשאה של אוליגו קשור למשטח המשלימים למתאמי הספרייה. כל שבר מוגבר אז לאשכולות משובטים מובחנים באמצעות הגברה של גשר. לאחר סיום יצירת האשכולות, התבניות מוכנות לרצף.
3. רצף – טכנולוגיית ה- SBS של Illumina משתמשת בשיטה מבוססת-שליחות קטלנית הפיכה המזהה בסיסים בודדים כשהם משולבים בגדילי תבנית DNA. מכיוון שכל ארבעת ה- dNTP הקושרים לטרמינאטורים קיימים במהלך כל מחזור רצף, התחרות הטבעית ממזערת את הטיה בשילוב ומפחיתה מאוד את שיעורי השגיאה הגולמיים בהשוואה לטכנולוגיות אחרות. התוצאה היא רצף מדויק מאוד על בסיס בסיס שמבטל למעשה שגיאות ספציפיות להקשר רצף, אפילו באזורי רצף חוזרים ונשנים.
4. ניתוח נתונים – במהלך ניתוח ומישור הנתונים, קריאות הרצף שזוהו מיושרות לגנום התייחסות (איור תלת ממדי). בעקבות יישור, וריאציות רבות של ניתוח אפשריות, כגון פולימורפיזם יחיד של נוקליאוטידים (SNP) או זיהוי מחיקת מחיקה (אינדל), ספירת קריאה לשיטות RNA, ניתוח פילוגנטי או מטגנומי ועוד.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X