טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 14

Malisbt 1

Malisbt 1

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 14

סיכום השיעור

  1. סיכום השיעור: סיכום שיעור 14-טכנולוגיות מתקדמות סיכום החומר שנלמד בקורס- SPECTRAL FLOW CYTOMETRY- כל נוגדן מזהה אפיטופ אחר, רוצים להסתכל על כמה שיותר סימונים. יש מספר לייזרים והתא עובר על פני כולם בזמן נתון. הלייזר פוגע בתא ויש לנו איניסייה. הוא מגיע ל- 32 TMT שמסתכלים על כל אורכי הגל שנפלטו. האיניסייה נאספת ומחולקת, מפוצלת להרבה אורכי גל, המכשיר יודע להגיד כמה יש מכל אורך גל.   יתרון במערכת ספקטרלית- שינוי בטכנולוגיה, מפריד בין תאים, כל תא והספקטרום שלו. הוא לא רק סורק הוא יודע לעשות העשרה. אם יש שני חומרים שהספקטרום שלהם דומה הוא יודע להפריד אותם.   מיקרוסקופ פלורוסנטי- למה נכנס מיקרוסקופ כזה? כי היו הרבה פרטים שהיה קשה לזהות ולהפריד ביניהם. שמים מנורה, פילטר ספציפי שמעביר אורך גל אחד. אם האובייקט מסומן בחומר פלורוסנטי ירוק אז נראה אותו. GFP- עשו שינויים במולקולה והצליחו לייצר מספר צבעים נוספים. המקור הוא ירוק. רזולוציה- כושר ההפרדה. ככל שההפרדה טובה יותר ניתן להבדיל בין הנקודות. ניתן לעשות מיקס של הרבה חומרים יחד והFAX הזה ידע להפריד אותם על פי הספקטרום שלהם.   מיקרוסקופ קונפוקלי-  מקור האור שלו הוא לייזר. הדיטקטור הוא FMP. יש שתי עדשות. הראשונה שוברת את האור והשנייה מחזירה אותו למצב הרגיל. מתבצעת סריקה של כל הדוגמא ויש עיכוב בזמן שצריך לקחת בחשבון. האיסוף הוא של נקודה נקודה. מראה דיכרואית- באורכי גל כחולים שוברת את האור ובאורכי גל ירוקים מחזירה את האור. המיקרוסקופ אוסף אור רק ממישור אחד, מה שלא במישור שלו לא מגיע לדיטקטור ונאסף במקום אחר. כשמסיים מישור אחד יורד נמוך יותר לרזולציה הבאה בתור על פי מה שהגדרנו לו. ככל שנגדיר יותר מישורים נאבד זמן (קריטי בדוגמא חיה). טכנולוגיות חדשות: FRET- הרעיון הוא מעבר של אנרגיות. קישור בין שני חלבונים, רוצים לראות למשל האם שני רצפטורים מתחברים על גבי ממברנה. המרחק בין שני החלבונים צריך להיות קטן מ-  10 ננומטר. לפעמים יש צורך בטיפול מקדים. FLIM- מודדים מולקולה פלורוסנטית כמה מהר היא נדלקת וכמה מהר היא נכבית. יש פיק קליטה של האור ופיק של פליטה. מודדים את זמן ההדלקה. FRAP-מעקב אחרי סינתוז של חלבונים. שורפים חלק מהמולקולה הפלורוסנטית בכוונה ובודקים כמה מהר החלבון מסונתז מחדש. יש חלבונים חשובים מאוד בתא והם מסונתזים מהר מאוד. אוספים את המידע וכמובן שיש גם ביקורות. משתמשים בד”כ במיקרוסקופ קונפוקלי כי יש לו לייזר.   TRIF- רזולוציה טובה בממברנה. טוב לכל מי שמתעסק בדמים או בחלבונים שמצויים על גבי הממברנה של התאים. אור שמגיע בזווית מיוחדת לדוגמא. STELLARIS- עיבוד תמונה מתקדם על ידי אלגוריתם חדש שעדיין לא פורסם. מיקרוסקופ שאוסף את האור בצורה מיוחדת. יש עדשה ומצלמה. המצלמה יודעת מאיזה מישור פוקאלי הגיע האור ולפיו מחשבת ומעבדת את התמונה. ניתן לאסוף תמונה מ- 5 חומרים פלורוסנטים שונים ושלא תהיה חפיפה ביניהם. המערכת אוטומטית לגמרי והיא לא תתאפשר זליגה של חומר אחד לשני. סופר רזולוציה- 3 טכנולוגיות עיקריות: SIM, STED, SMLM. בכולן אפשר להשתמש בלייב אימי’ג וכמובן שיש כאלה שמתאימות יותר ופחות.   DNA וריצוף- ב- 1962 נעשו הניסויים הראשונים בבני אדם בליפוזומים. הבעיה בליפוזומים שהם לא יציבים וכלן זה לא תמיד יעיל. FISH- פותחים כרומוזום על ידי דנטורציה ומכניסים פרוב פלורוסנטי שנקשר לאיזור ספציפי. הפרוב ייקשר גם אם יש מוטציה בתוך האיזור שאליו הוא נקשר. בשימוש רב בבתי חולים. דורש מיומנות ועיניים טובות. DNA זבל- במשך עשרות שנים חשבו שלדנ”א זה אין תפקיד חשוב, בהמשך גילו שיש לו תפקיד חשוב ברגולציה. DIGITAL PROB PCR- מכניסים כל פרקציה לחתיכת שומן, בועית ושם מתבצעת ריאקציית ה PCR. יתרון בשיטה היא שלא צריך עקומת כיול או גן שאליו משווים את התוצאה.   דיגיטל PCR שוברים דנ”א לחתיכות קטנות. כל חתיכה תיכנס לבועית ום תתרחש ריאקציית PCR (בכל בועית יש את כל החומרים הדרושים) בסופו ל דבר מקבלים מספר אבסולוטי ואנו יודעים בדיוק את כמות הוירוס. MICROARRAY יש צ’יפ ועליו מקובעים פרובים מסויימים ורציפים משלימים עם קישור חזק וחלש. יש תגובה פלורוסנטית וסיגנל. ניתן לבצע סריקת מוטציות חלקית ולא מלאה. לוקחים רקמה בריאה ומשווים אותה לרקמה חולה, רואים באיזה באריות היתה תגובה ובודקים את ההשתנות של גנים מסוימים. ריצוף עמוק- מסתכלים בדרך כלל על ביטוי רנ”א. בעבר ריצפו גן אחד כל פעם. הרעיון כאן הוא לרצף במקביל מספר גנים. יש מספר טכנולוגיות כולן מבוססות על פליטה של אור. מייצרים ספריות דנ”א, מכינים את הטמפלט (במצע) מרצפים ומבצעים אנליזה של התוצאות. יצירת ספרייה- שוברים את הדנ”א לחתיכות, לכל סגמנט מוסיפים ברקוד, מכפילים את הברקודים והספרייה מוכנה.   ריצוף עמוק NGS- מסתכלים על רנ”א או דנ”א. הרעיון הוא לרצף כל מה שיש לנו. לוקחים את הרנ”א או הדנ”א והופכים אותו ל- cDNA. שוברים את ה- cDNA למקטעים קצרים של 150BP. לכל מקטע כזה מחברים רצף ידוע- ברקוד על מנת לזהות מאיזה חולה הוא הגיע. מחברים בעזרת PCR. מחברים למקטע רצף נוסף, שנקשר לאילומינה. ב – FLOWCELL יש פריימרים מסוג T7 וt3  שהם פריימרים מוכרים עם 18 בסיסים שחוזרים על עצמם. מתחילים להוסיף נוקליאוטידים מסומנים פלורוסנטית, כל הוספה יש עצירה וקריאה על ידי צילום. מסנתזים את הגדיל משני הכיוונים. כך שלמשל לכל מקטע יהיו 2 רצפים משלימים מכיוון אחד ומהכיוון השני. בסוף התהליך מקבלים המון REDS (400-600 מליון) ויש צורך בביואינפורמטיקה ופירוש של התוצאות. לכל חלק בגן יכולות להיות 20 קריאו שונות, ולא הריצוץ נקרא ריצוף עמוק לתוך הגן. ביחד זה נותן לנו מידע אמין והדיר של הריצוף. הקריאה עצמה נעשית על ידי צילום ב-  פילטרים שונים שקוראים את ארבעת הנוקליאוטידים הקיימים, בכל איזור מתקבלת הקריאה המתאימה.   ION TORENT- יש לנו את הגדיל וכל פעם מכניסים נוקליאוטיד אחד. זה עובד על זרם חשמלי שמשתנה בהתאם להפרשת פרוטון. את הגדיל עצמו יש צורך להכפיל כדי לקבל צבר שאותו מחברים לביד מסויים. מה שנקרא זה המתח החשמלי, אין מצלמה. משתמשים בנוקליאוטידים פשוטים ללא מניפולציה. מגיעים ל- מליון REDS.   ריצוף ברמת התא הבודד- mRNA- הכנסה של תא בודד לבועית שמן. מכינים אותם בעזרת צ’יפ מיקרופלואידי. כל בועית היא מבחנה. רוצים לרצף כל תא בודד ולהכניס אותו ל-CLUSTER מסוים. ניתן לראות את היחס הגנים פר תא בודד. מכינים ספריות. ניתן לעשות תהליך מקדים של SORT במכשיר פקס ואחר כך לרצף ברמת התא הבודד. מוציאים את התאים המתים. משתמשים במיקרופלואידיקה, מזרימים שמן למערכת כך שכל טיפה עוטפת תא בודד שמכיל גם ביד עם חומרי הפקה. לכל תא ברקוד שונה. בתוך הבועית התא עובר מייד ליזיס ונחשף ה- mRNA. הריצוף נעשה באילומינה והשלב הסופי הוא עיבוד המידע בביואינפורמטיקה. DROPSEQ- היא שיטה כזו שלא ריצוץ ברמת התא הבודד של mRNA. כל בועית מכילה 2 ברקודים ו- POLY T

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X