טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 14

Shani israela sadon

Shani israela sadon

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 14

סיכום השיעור

 

טכנולוגיות מתקדמות –  שיעור מס’ 14:

 

 

בנוהל, דיברנו קצת על הקורונה.

 

בשיעור הזה  עשינו חזרה על החומר:

STOKES SHIFT: הפיקים של 2 צבעים הם אומנם רחוקים אך האקסיטציה והאימישן שלהם קרובים ויכול לגרום למצב של false positive ויוצר מצב של overlay(הפתרון הוא קומפנסציה).

:PNT בסוף התהליך יכולה להיות מצלמה שמצלמת את התאים או PNT (מכשיר שמקבל פוטון והפוך אותו לאלקטרון. הוא גם יכול להכפיל את האלקטרון הזה (ככל שהוולטז’ גבוה יותר, משתכפל יותר).

* סימון פלאורוסנטי- נמצא חלבון פלוארסנטי במדוזות  GFP ומשתמשים בזה ברוב השיטות המעבדתיות החדשות. מרבית הטכנולוגיות והפיתוחים  המדעיים מתבססים על סימון פלואורסנטי.

* Flow cytometry: שיטה להפרדת וסימון תאים. FACS = fluorescence activated call sorting

ישנם סוגים רבים של מכשירים אך כולם מכילים 3 חלקים: חלק פלואידי (נוזלי):  הדגימה מועברת עם נוזל pbs משני צידיה היוצרים לחץ  זרימה המאפשר למכשיר לקרוא תא אחד-כמה תאים  בכל פעם.

הקטנת עוצמת הזרימה מעלה רזולוציה אך קיימת בעייתיות כאשר מספר התאים קטן.

חלק אופטי מכיל את כל העדשות, פילטרים ומערכת לייזרים בצבעים שונים(לרוב זה לייזר אדום כחול וסגול) שבעזרתם ניתן לזהות את התא.  משתמשים בPMT=photomulriplier tube. Voltage optimization

בכדי לזהות את רמת הפלורסנציה  בדגימה. האור הראשוני מגיע ל pmt  ומוגבר בתוכו בכדי לשפר את רגישות הרזולוציה של הבדיקה.

החלק השלישי הוא החלק האלקטרוני: עיבוד הנתונים והאנליזה  ע”פ גרפים.

יש 3 פרמטרים חשובים לפלואו: FS = forward scatter מעיד על גודל התא, Ss =side scatter זה על  (גרנולוגות, אברונים וכו) מורכבות התא , וחיוביות/שליליות למקרים CD.

כמו כן לכמות הנוגדן על התא יש השפעה..

–           Quality control: CST: cytometer setep and trcking: calibration beads ג’לי קטן המכיל את כל הצבעים האפשריים ובעזרתו המכשיר בודק שהכל מכוייל

–           Adjustment of detector voltage: משנים את הtrashold  (נק’ מסויימת על הגרף שמחתיה אני לא רוצה לראות כלום, לדוגמה ביטול האריתרוציטים מהתמונה),

–           קומפנסציה זה תהליך שאנחנו מבצעים בכדי לגשר על בעיית הoverlay  לדוגמה בין PE ל FITC . אני מפסידה נתונים בתיקון אך מקבלת תשובה יותר מחודדת.

–           Gating: בידוד אוכלוסיה ספציפית והמשך האנליזה עליה (לדוגמה בידוד אחוז הלימפוציטים ומתוכם, כמה חיובים למרקר CD3, זה מסמן לי את תאי T, מתוכם מסמנת חיוביים לCD 56, אלה NKT וכדומה.

Sorting FACS:

  • טכנולוגיותLIFE TIME פחות רלוונטי לFACS בגלל כמות התאים בשניה. לחומר פלורסנטי יש זמן כיבוי והדלקה
  • ELECTROSTATIC FLOW SORTING – מחפשים את נק’ השבירה=BREAKOFF, הכי חשובה שבה אני מחליט איזה תאים אני טוען (שם כבר אין מטען חשמל)

טכנולוגיה נוספת היא עם תמונה flow imaging ב12 ערוצים שונים מסתכלים על התא כמעט ברזולוציה של מיקרוסקופ. כאן זה לא יחסי, זה פיקסליםועל פי זה אני יכולה לדעת מה גודל התא ומה המיקום של החלבון שאני מחפשת.

פלואו ספקטרי: עד 14 צבעים. אוסף מידע באורכי גל של 420-800 ננו מטר, 10 פריזמות ודטקטורים נפרדים. בא לעזור בעיקר עם הבעיה של overlap בין הצבעים (שמצריכה קומפנסציה) ע”י יצירת ספרייה של אוטופלורסנציה של כל תא (spectral library ) ובאמצעותה אפשר להשתמש במספר צבענים אשר פולטים אור באותם אורכי גל (לדוג’ apc and alexa flour).

  • מערכת קודקס: משתמשות בהרבה צבעים וגם מראים מיקום. כל פעם מתחפים 3 צבענים החוצה. נוגדן עם חתיכת דנא עליו ואיזשהו ברקוד. כל פעם מכניסים שלישיית צבענים עם ברקוד, מסלקים אותם ואז שמים שלישייה אחרת. החסרונות טמונים באימונו היסטוכימיה זה לא משהו חי, יש שטיפות, לוקח המון המון זמן (דומה מאוד למערכות של ריצוף ) והרזולוציה לא מגיעה לרמת התא הבודד כמו שאנחנו רוצים ופחות על רקמה. פתרו את בעיית הפלורסנציה החופפת.
  • THE MACSQuant Tyto מערכת של צ’יפ מיקרופלואידי. מע’ איטית מאוד אך יש לה יתרונות רבים.בעצם אחד היתרונות המרכזיים הוא שכל דגימה שאני מביא אני מחליף את כל המערכת התוך תאית של המכשיר. ולמה זה טוב לי? שמירה על סטריליות. בתוך המע’ יש אינקובטור ובקרת טמפ’ וכן הוספת חומרים בצורה רובטית. אפשר לאסוף 2מל פוזיטיב (עושה סורט חיוביי לאוכלוסיה אחת. אפשר לעשות הרבה גייטים אבל כל פעם אוכלסיה אחת. תבענים אפשר כ12-15 צבעים) ועד 10 בנגטיב. במכשרים אחרים אפשר גם 40 מל. אפשר לסרוק עד 3 שעות (הפוסיטיב באמצע, הדוגמה בצד שמאל, הנגטיב  בימין).. יתרונות: הוא סטרילי, עדין לתאים (לחץ מאוד נמוך, נותן לנו לעבוד עם תאים חיים ורכישים, לא נהרסים), בטיחותי (בעיקר במקרה של דגימה מזוהמת) וקל לשימוש (אין צורך לנקות לייזר ולכייל מעבר). אי אפשר להוסיף לו לייזרים רק כחול, ירוק, אדום וצבענים ספציפיים עד 8 צבעים בלבד רק SC וFC.
  • מיקרוסקופ הפוך-מיקרוסקופ אינברטד (הפוך) הואמיקרוסקופ בו מקור האור עליון והאובייקטיבים נמצאים מתחת לדגימה הנצפית (לכן הוא נקרא מיקרוסקופ הפוך). מיועד לצפיה בתרביות תאים הגדלים בתחתית באריות, כאשר התאים חיים במדיום נוזלי
  • מיקרסקופ פלאורוסנטי-מיקרוסקופ פלואורסנטי הוא מיקרוסקופ אור המאפשר זיהוי מולקולות ספציפיות באמצעות חותם ספקטרלי ובכך מתגברת על בעיית הרקע הקיימת במיקרוסקופ אור רגיל. הוא עושה זאת על ידי שימוש במנורת הלוגן חזקה כמקור אור, מנורה כזו מספקת מגוון רחב מאוד של אורכי גל. ניתן לצבוע אברונים מסוימים בתא בצבע פלואורסצנטי. צבע זה משמש כגלאי, העשוי חומר פלואורסצנטי.
  • מיקרסקופ פלאורוסנטי קונפוקלי-הבסיס למיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא השימוש במסננים מרחביים (חרירים), המאפשרים לבטל אור שמקורו מחוץ למוקד, המפריע להיווצרות תמונה ברורה במיקרוסקופ אור רגיל. בשנים האחרונות המיקרוסקופ הקונפוקלי נחשב למבוקש, בגלל הקלות היחסית של קבלת דמויות באיכות גבוהה של דוגמאות שהוכנו לצפייה תחת מיקרוסקופ רגיל.בעוד במיקרוסקופיה רגילה, שהיא מיקרוסקופיית שדה רחב, כל הדוגמה נשטפת באור, והתמונה יכולה להראות ישירות בעין או באמצעות מצלמה, במיקרוסקופ הקונפוקלי, מקור התאורה הוא בקרני לייזר הסורקות את הדמות פיקסל אחר פיקסל. חלקי הדמות נקלטים על ידי גלאי, ומורכבים לדמות המתקבלת על צג מחשב. אמנם, ניתן לראות בשיטה זו דוגמאות שאינן צבועות, אבל עדיף להשתמש בצביעה בגלאים פלואורסצנטיים.מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מציעה מספר יתרונות שהן מעבר למיקרוסקופיה אופטית, ובכלל כך שליטה בעומק השדה, הירידה באיכות הדמות ככל שגדל המרחק מהמוקד, והיכולת לצפות בדוגמה עבה באמצעות צפייה סדרתית בחלקים דקים מתוך דוגמה .
  • FRET- באנגלית: Fluorescence Resonance Energy Transfer הוא תופעה פיזיקלית המתארת מעבר אנרגיה בין 2 מולקולות רגישות לאור (כרומופורים).בתהליך זה, הכרומופור התורם מעורר על ידי בליעת אור (פוטון) לרמת אנרגיה גבוהה יותר, אך אינו פולט אור. במקום זאת, מתקיים מעבר אנרגיה באמצעות צימוד דיפול דיפול אל רמת העירור בכרומופור המקבל (acceptor). כתוצאה מכך, המקבל פולט אור (פלואורסצנציה).
  • FLIM- זמן החיים של מולוקולה פלואורוסנטית
  • FRAP- Fluorescence Recovery After Photobleaching , היא שיטה מיקרוסקופית אופטית למדידה של דינמיקה בתאים חיים. השיטה מבוססת על שילוב של מספר שיטות הכוללות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שימוש בקרן לייזר לביצוע הלבנה של הפלואורסצנציה וכן שימוש בשיטות סימון של חלבונים (או מבנים ביולוגיים אחרים) בעזרת חלבונים פלואורסצנטיים כמו GFP. חלבון הנמצא בתא החי נע בדרך כלל בתנועה אקראית, או בדיפוזיה, ובנוסף הוא יכול להתקשר ולהתנתק לחלבונים או מבנים אחרים.
  • סופר רזולוציה:

יש שלושה סוגים עיקריים של טכנולוגיות כאלו:

  1. SIM – ננוסקופיה ברמת הננומטר
  2. STED – Stimulated emission depletion- אופטית אמיתית לגמריי ללא עיבוד תמונה. היחידה בעצם. גם כאן מקרינים במולק פלורסטית שהיא פוטואקטיביטור במקור אור היא נדלקת ונכבת מיד ויש הדלקה וכיבוי בזמן שונה ואז ניתן להתעלם מכל השחור אלא רק הנקודה שנדלקת.שורפים את המולקולות שמסביב.

  1. STORM:  כל פעם מדליקים נקודה אחת ספציפית ומכבים ואז מתפקסים בה. באופטיקה מתקבלת תמונה של מעין גליל וזה פוגע ברזולוציה. אורך גל של 400 יתן לי להפריד בין 2 נקודות של 200 (כחצי) פחות מזה לא אוכל להפריד . תלויה בעדשה ובאורך הגל. לדוגמה אם יש בתא 3 מולק שעברו אקסיטציה באותו זמן לא אוכל להפריד בינהם אך אם נעשה אקסיטציה בזמן שונה אז נוכל להפריד. משתמשים במולקולות מיוחדות ובכמות נמוכה של מקור אור אז הסיכוי שלהם לעבור אקסיטציה הוא נמוך אבל בגלל שעושים את זה הרבה אז יש סיכוי שידלק. כל הזמן מדליק ומכבה ונחפש את האיזורים שנדלקו נקודתית – כמעט ולא נראה אחד ליד השני. ההבדל בין עומצת ההדלקה לעוצמת הכיבוי היא יותר חזקה . הבעיה היא איטיות בעיקר, קונטרסט בפרובים פלורסטים חייב להיות גבוה, המון background noise .

הטכנולוגיה הראשונה היא FISH- אחד הבעיות העיקריות במע’ זאת היא שלוקחים פרובים (מסומנים פלורסנטית) גדולים מאוד שנכנסים לגדילים ואפשר לראות בעזרתם במיקרוסקופ את הטלומרים למשל, (2 נקודות זה לפני חלוקה, הדנא השתכפל), אברציות כרומוזומליות שונות , טרנסלוקציות.

נעשה בשימוש גם ב IVF,PGS. הבעיה היא שיש גבול לכמות הצבענים שאפשר להשתמש בה בגלל OVERLAP  וכן גודל הפרוב. מה גם שדרושה מיומנות גבוה להשתמש בזה.

  • דנא נמצא בתוך הגרעין (בכרומוזומים). יש שם  “מפעלי ייצור” רנא במקומות קבועים. הדנא מרכיב גנים. גן הוא נושא אינפורמציה למשהו ביולוגי מבנה\תפקוד. לאדם 20 אלף גנים, כל אחד 1000-3000 בסיסים. האינפורמציה נמצאת בסדר בו נמצאים הנוקליאוטידים. לכל תא\ רקמה יש קומבינציה אחרת שמובילה לפעילות אחרת של החלבון. הדנא חייב להיות מועתק במדוייק.
  • יש 3 תהליכים עיקריים: שכפול, שעתוק  (חלק מדנא נפתח במקום ספציפי ומשמש כתבנים לסינתזתMרנא. שונה משכפול בכך שנותן ליצור כמה עותקים מעותק אחד) ותרגום (לחלבון).
  • בעזרתALTERNATIVE SPLICING נוכל ליצור MRNA בוגר (אי אפשר לגעת בסדר רק בצירוף שונה לאקסונים).
  • יש כ20 אלף גנים שאינם מקודדים אך משמשים להגנה ורגולציה.
  • PCR:  תגובת שרשרת של פולימראז. שיטה מעבדתית המשמשת לשכפול מזורז “אמפליפיקציה של מקטעי DNA.

נהוג להשתמש ב-PCR לסריקה אחר מחלות גנטיות ולביצוע ניתוח השוואתי של DNA מאוכלוסיות שונות, כולל DNA ממינים נכחדים. עקרון הפעולה של המכשיר כולל 3 שלבים בכל מחזור: Denaturation; דנטורציה בחום, איחוי (Annealing) של פּריימרים מתאימים לקצוות המקטע שאותו רוצים לשכפל והארכה (Elongation) באמצעות אנזים DNA פולימראז העמיד לחום, המכונה Taq DNA פולימראז. המכשיר חוזר על שלבים אלו של מחזור ההכפלה, כמה עשרות פעמים (בדרך כלל 25-30), עד להגברה המבוקשת של המקטע.  יעילותו הרבה של המכשיר טמונה ביכולתו לשנות את הטמפרטורה במבחנות במהירות רבה, בזמנים קצובים, ברציפות ולאורך זמן. הפרימה נעשית בדרך-כלל בחום של כ-95 מעלות צלזיוס, האיחוי נעשה בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס (בהתאם לאורך ולהרכב התחלתיים) וההתארכות בטמפרטורה של כ-75 מעלות צלזיוס (שהיא טמפרטורה אופטימלית עבור האנזים Taq דנ”א פולימראז), וחוזר חלילה.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X