טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 13

ליאורה סטודנטסקי

ליאורה סטודנטסקי

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 13

סיכום השיעור

8/03/2021  שיעור מס’ 13

SMFISH

Histone modification משווים ריצוף של DNA ל RNA למשל של רצפים הפתוחים ללא היסטונים.

ריצוף לפי מיקום ברמת הרקמה

RNA-FISH

Imunofluorensence

Imuno-histochemistry

MIBI-TOF מערכת עם נוגדנים להם מחוברת מתכת כבדה שמזוהה ע”י מס-ספטרומטריה

 

אם רוצים לדעת כמה חלבונים היו בגידול סרטני ומיקום שלהם ברקמה.

  1. צובעים את הרקמה הסרטנית ב-3 צבעים פלורוסנטיים.
  2. לוקחים אזור צבוע מרקמה הסרטנית ואחר מרקמה הבריאה ולהשוות ביטוי גנטי וחלבוני

Spatial Transcriptomics

 

המשך משיעור שערב על ספריות– Single cell expression masanger RNA   ברמת התא הבודד מפיקים DNA והופכים אותו ל c DNA  עושים אמפליפיקציה ומכינים ספריות, מצמידים ברקוד לכל רצף שנדע מאיפה הוא- מאיזה תא. אחרי שמסמנים את הרצפים קושרים אותם לפלטת זכוכית ומכניסים למכשיר Illumina.

שיטה נוספת הפקה בתוך בועיות ג’ל- בידוד תאים – מצד אחד מזרימים תאים ומצד אחר מזרימים בידים- בועיות

כל תא נכנס עם בועית ג’לי שבתוכו מפיקים c DNA  ואז בבועית יש את הספרייה הדרושה והבועית הדרושה הולכת לריצוף. כל ביד מסומן בברקוד כדי שנוכל להפריד אותו באנליזה, מכיוון שהכל בסוף מתערבב.

Cell surface protein– חלבונים שעל פני התא נותנים לנו מידע לגבי סוג התא. בשלב הראשון ניתן להפריד תאים ע”י מכשיר הפקס. למשל בוחרים לעבוד עם תאים שיש להם CD4, CD8, לאחר מכאן לוקחים את התאים למכשיר שיכין ספריות- כל ספריה עם הברקוד שלו ובתוך בועית ויש תערובת של בועיות מסומנות.

בשלב האחרון לוקחים את התערובת בועיות  למכשיר ריצוף- למשל Illumina.

הריצוף נותן כמות, ביטוי והרכב נוקלאוטידים ברצפים.

Intraccellular protein (PEA)ריכוז שלהם בתאים שונים אינו זהה, הרבה פעמים יש אים עם ריכוז ממוך מאוד. בודקים ברמת הביטוי של החלבונים ההלו אם ישנם בתאים. על אותו חלבון מלבישים באפיטופים שונים 2 נוגדנים ומסתכלים האם הם נוגעים (עושים חיבור גשר) אחד בשני- PEA-Hybridization method

בצורה כזאת בונים קלסטרים- סינטזה של קלסטרים.

Pseudotime– ניתן לעשות הרכב לפי שלבים. בכל שלב התפתחות של תא ניתן לגלות איזה גנים ישנם ואזה לא קיימים בשלב ספציפי ולעשות מפה.

Hystone modification – אנליזת התא הבודד ברמת הריצוף. אפשר לזהות בתא בודד אזורים פתוחים (של רצפים פתוחים) ולבצעה במקום הזה RNA Expression ריצוף. מרצפים רק אזורים פתוחים ומשווים אותם ל RNA.

זה תהליך שנמשך 2-3 חודשים.

Chip sequences– שיטת ריצוף על גבי צ’יפ

משתמשים ברצף בודד Transcription factor (עושים הכפלה לאזורים פתוחים שבהקסונים) בעזרת נוגדנים חותכים את ה  DNA במקום מסוים ומסתכלים לביטוי של איזה גן זה הוביל.

–          ניתן להפריד נוגדן ע”י בידים ששוקעים סרכוז

–          להצמיד ביד מגנטי ולהפריד ע”י הפרדת ביד מגנטי לצד המבחנה.

לאחר מכאן עושים ריצוף DNA על גבי הצ’יפ.

בשיטה הזאת עושים ריצוף פשוט של אזורי הטרנסקריפציה ואש עושים  q PCR ל3-5 גנים שנבחרו (אליהם חייבים לבחור פריימרים).

ריצוף לפי מיקום ברקמה

שיטות קיימות:

Fish – DNA, RNA – היברידיזציה עם פרוב.

Immunofluorescence

Chemical sensors

ברמת ה-DNA אפשר לראות היברידיזציה וסוגים מסוימים אחרים – טכניקות לראות DNA

Mass spectrometry

Fluorescence

ריצוף ברמת הרקמה- מערכת שמבוססת על נוגדנים עם מתכות כבדות. המערכת סורקת נקודה- נקודה ומזהה את הנקודות בהם יש מתכות כבדות- מתכות כבדות יוצרים פיקים גבוהים בקריאה של מערכת.

 MIBI- TOF Technology הרעיון להשתמש במתכות כבדות שניתן לזהות ע”י Mass spectrometry.

לוקחים רקמה היסטולוגית ושמים עליה כ- 180 נוגדנים שבראש כל נוגדן מוצמדת מתכת כבדה- המערכת שורפת אותם וכך יודעים כמה מתכת כבדה היה בתא – לפי זה יודעים איזה נוגדנים היו וכמה.

שיטה נוספת- Digital Spectral Profiler

שני פרובים- אחד נקשר ל RNA וברוב נוסף נקשר לנוגדן.

בשיטה הזאת נקבעים 2 פרמטרים:

–          כמות חלבונים

–          סוג חלבונים ברקמה.

בשלב ראשון צובעים רקמה סרטנית, רוצים לראות למשל גרעין, CD35 וכו’

הרקמה נצבעת למשל בצורה של תאים סרטניים באדום ותאים בריאים בכחול ואז ניתן לבחור אזור של רק תאים סרטניים לפי צבע ומרצפים- ניתן להסתכל על ביטוי RNA או על חלבונים.

בוחרים אזור מסוים שרגיש ל UV סמים נקודה על האזור אזור מסוים עם 30-40 תאים ומקרינים ב UV מה שמשתחרר זה רצפים שעל האזור הנבחר.

מורידים “קשית” שלוקחת את ה DNA של האזור שהשתחרר. אפשר להוסיף עוד נוגדנים. כל ה DNA של אזור מסוים (לפי צבע) מכניסים לתאים בפלטה של ספריות לפי אזורים ברקמה.

כל התהליך נעשה ללא מגע יד אדם, הרצפים נשאבים ע”י קשית ומקבלים ברקוד ישר מהרקמה ונכנסים לבערית להמשך תהליך- ניתן לקבוע כרגע את סוגי הרצפים, חלבונים, קולטנים שהיו על התאים

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X