טכנולוגיות מתקדמות

סיכום שיעור 14

AnnaMikhov

AnnaMikhov

פרטי הסיכום

קורס: טכנולוגיות מתקדמות

מספר השיעור: 14

סיכום השיעור

הפרדת תאים -FACS- מזרימים לחץ חיובי ותאים נעים למלה ממקדים תאים מול לייזר מנסים שכל פעם רק תא בודד יעבור, כמה שתאים יותר עגולים כך תוצאות יותר אמינות. FACS היא סוג מיוחד של Flow Cytometry  , שמאפשרת מיון תמיסת תאים ביולוגיים לשני מיכלים או יותר, תא אחד בכל פעם,שמבוסס על פיזור האור הספציפי והמאפיינים הפלואורסצנטיים של כל תא. זה שונה מציטומטריית זרימה באופן שהוא מספק אפיון ייחודי לעומת ספירת ומיון תאים בלבד . בפאקס רגיל בהמיסיה שמים פילטרים אבל יש בעיה זליגה לתוך צבעים שונים- צריך להפריד תוצאות -אם מורידים טעויות סיגנל הרבה מידע נאבד. יש בעיה של אוטופלורוסנציה -נקבעת לפי מולקולות שעל ממברנה וככל שממברנה משתנה כך גם אטופלורוסנציה משתנה. יציאה של ליזר -תא עובר כל זמן שונה מול לייזר שונה, המיסיה מגיעה למראה ולפריזמה ,אוספים כל המיסיה בניפרד. שינוי במכשיר: רעיון הוא איסוף נתונים במקום PMT  אחד אלה 32 PMT שונים, שמסתכל על כל אורכי גל שנקלטו. התאמה ספקטרלית- כל חומר שעולה מלייזר כחול עובר החתמה. Mass cytometry: An-“omics” Tool – במקום נוגדן עם פלורוסצנציה יש מתכות כבדות- סורק ובודק מולקולה ב MASS ציטומטרי, אין בתהליך סורט יש רק אנליזה והיא רצינית מאוד לפי המסה שלהם.Single Cell Gene Expression and cell surface proteins.  -מצרפים נוגדן קשור בקשר SS לרצף DNA מסוים בסוף תהליך מקבלים תאים כששמים אין סוף נוגדנים יהיה ביטוי של אין סוף נוגדנים, נוגדנים נקשרים בכל מקום. מיקרוסקופיה פלואורסנטית-פילטר 480/30 הבדל של 30- מסוגל להעביר אורך גל 480 נמ (+-15) 465-495 נמ. מקור אור שמעביר אור לבן פוגע בדוגמא ושמים פילטרים כדי שנראה רק צבע אחד. למשל לוקחים לייזר 488 ומבקש להשתמש ב4 פילטרים אחוז הצלחה 88% נותן % של זליגה אחד על השני. Real-Time PCR- ככל שיש יותר מהר בסייקל נמוך פליטת פלורוסצנציה יש הרבה חומר DNA. מתחילים לעשות סייקלים של PCR אם בהתחלה בדגימה היה הרבה חומר גנטי אז כבר בסייקל 12-13 נראה פלורוסצנציה, כל נושא של RTPCR זה יחסית לביקורת של גן שבודקים עקומת הכיול שלו- כל מה שמקבלים זה ביחס לתוצאות אלה, תשובה יחסית. פריימרים  SYBR Green I לא ספציפיים, פריימרים TaqMan probe ספציפיים. NGS- רעיון הכללי: יש לנו נוקלאטידים,לוקחים פילטרים(כמו בפאקס) על כל נוקלאוטיד שנוסף מקבלים פלואורסצנציה. NGS-ריצוף עמוק על RNA/DNA , לוקחים RNA הופכים לcDNA  ,שוברים אותו לחתיכות עד 150 נוקלאוטידים, מוסיפים- אדפטורים(שיתקשר למערכת סיקוהנסינג) וגם ברקודים (רצף של 18 נוקלאוטידים ידועים שנדע מאיפה זה בא. לרצף שלנו שהוספנו מולקולה שנקשרת למולקולת ילומינה-בסופו של דבר מתחילים להוסיף נוקלאוטידים שמסומנים בסמן פלורוסצנטי כדי לרצף. שלב 1- סורט- לוקחים כל תאי דם פרפרים ומבודדים תאי T, שלב 2- יצירת ספריה פר תא בודד, ושלב הכי חשוב 3- ריצוף באילומינה. לכל תא T יש אותו אפיטוף ואז יש תא T עם אפיטוף אחר, בשלב 1 עם פאקס מפרידים את כל תאי T החוצה למבחנה ורק את אלה שמבטאים CD4/CD8 .ואז נקח RNA או DNA ועושים אותקים של אזור הואריבילי ובשלב אחרון לוקחים למכשיר של אילומינה, ריצוף נותן מידע על כמת ביטוי וגם מה הנוקלאטידים  שנמצאים שם. במקום לרצף את MRNA עצמו אפשר לרצף נוגדנים שיש להם רצפי ברקוד, אבל בסוף צריך להגיעה ל10 X Genomic שיכין לספריה מיוחדת ואז יש ריצוף.

עריכת הסיכום

iw עִבְרִית
X